Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

NOTA: O protocolo, conforme descrito abaixo, não inclui qualquer informação de identificação do paciente e, portanto, não é considerado experimentação com seres humanos pela Universidade de Washington Institutional Review Board ou Seres Humanos Divisão. 1. Construção de quimérico de HIV-1 NL4-3 clones moleculares 1.1) Amplify Inserir DNA Fragment Conceber iniciadores quiméricos. O metades 5 'de ambos os iniciadores para a frente e reverso contêm uma sequência de vector de HIV-1, em que o fragmento será inserido. A "metade dos iniciadores 3 deve conter a extremidade da sequência de inserção (Figura 2). Certifique-se de que a sequência de iniciador quimérico retém os quadros de leitura abertos originais. Use iniciadores, pelo menos, 20 bases de comprimento, com uma temperatura de fusão maior do que ou igual a 60 ° C, ~ 50% de teor em GC, e uma baixa tendência para formar dímeros de iniciadores, heterodímeros e / ou estruturas em gancho de cabelo. Avaliar essas propriedadesutilizando a ferramenta web OligoAnalyzer ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). A utilização de PCR 27 e os iniciadores quiméricos para amplificar DNA de inserção (Figura 2). Para cada reacção de PCR, utilizar 1X tampão de alta fidelidade, dNTP 0,2 mM, 1 U de DNA polimerase de alta fidelidade, 0,5 pM de iniciador quimérico para a frente, 0,5 pM de iniciador quimérico inversa, e uma pg0 ng de amostra de DNA contendo a região de inserção. Adicionar dH 2 O para um volume final de 50 ul. Definir passos de ciclos térmicos do seguinte modo: executar um passo de desnaturação inicial de ADN a 98 ° C durante 10 seg. Amplificar com 30 ciclos de desnaturação de ADN a 98 ° C durante 10 seg e emparelhamento de DNA a 3 ° C acima da temperatura mais baixa de fusão dos dois iniciadores para 20 seg. Realizar uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Armazenar produtos de PCR a 4 ° C. Tirar 5 ul dos produtos de PCR a partir daetapa anterior e executar electroforese em gel de agarose a 28. Usar um gel de agarose a 0,7%, 1x tampão TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM de EDTA), 0,5 ug / ml de brometo de etídio (EtBr) a concentração final e escada de 1 kb como o marcador de tamanho de ADN. Set tensão fonte de energia para 5 V / cm de distância entre os eletrodos. Pare a electroforese quando o corante de carga migra através de cerca de 2/3 do comprimento do gel. Visualize o gel usando um sistema de documentação de gel 28. NOTA: EtBr é um cancerígeno e deve ser descartado adequadamente, de acordo com regulamentos da instituição. As luvas devem sempre ser usado quando manusear géis contendo EtBr. Mude para novas luvas após EtBr manipulação acabamento contendo material e antes de manipular outros materiais ou equipamentos para evitar a contaminação cruzada. Se for detectada uma única banda de ADN com o tamanho correspondente ao produto de PCR desejado, purificar o resto do produto de PCR, utilizando um kit comercial, tal como PCR Purification Kit QIAquick acordoção com os protocolos do fabricante. Caso outras bandas não específicas também estão presentes, utilizar o resto do produto de PCR para executar electroforese em gel preparativa. Use os mesmos parâmetros e condições especificadas no passo 1.1.4. Certifique-se de que o poço de gel é suficientemente grande para carregar ~ 45 ul de produtos de PCR. Cortar a banda de interesse e extrair o ADN a partir do gel utilizando o kit de extracção de gel QIAquick de acordo com os protocolos do fabricante. 1.2) Introduzir o Insert Fragmento em Full-length Infecciosas HIV-1 subtipo B vetorial (pNL4-3) Use produtos de PCR purificados a partir do passo 1.1.5 como iniciadores de PCR. Use pNL4-3VifA 20 como ADN molde em uma reacção de PCR e usar pNL4-3VifB 20 como molde na reacção de outro (Figura 2). Para cada reacção de PCR, utilizar tampão 1x alta fidelidade, os dNTP 0,2 mM, 2 U de polimerase de DNA de alta fidelidade, 500 ng de ADN do iniciador e 50 ng de ADN molde num volume final deume de 50 ul. Definir os parâmetros dos ciclos térmicos a: 98 ° C durante 30 seg, 35 ciclos a 98 ° C durante 10 seg, 48 ° C durante 1 min e 72 ° C durante 10 min, seguido de 72 ° C durante 10 min. Adiciona-se 10 U de Dpnl para 50 uL da reacção de PCR e incubar a 37 ° C durante 1 h para digerir o ADN molde. Assegure-se que o DNA de plasmídeo é isolado a partir de uma estirpe bacteriana competente metilação, por exemplo., Escherichia coli TOP10 quimicamente competente. Uso Dpnl produto digerido para transformar células bacterianas competentes. Use transformação de choque térmico com TOP10 quimicamente competente E. coli, de acordo com o protocolo do fabricante. Para seleccionar as células bacterianas que contêm o plasmídeo recombinante, usar Caldo de Luria (LB) placas de cultura contendo 100 mg / l de carbenicilina. Escolha ~ 10 colónias bem separadas e crescem, cada, separadamente, em 3 ml de meio LB líquido contendo 100 mg / l de carbenicilina e incubar a 30 ° C numashaker O / N. Use QIAprep spin kit miniprep para isolar o DNA de plasmídeo a partir da cultura bacteriana líquida, de acordo com o protocolo do fabricante. Use digestão de restrição dupla 29 para determinar se o DNA do plasmídeo contém o inserto correcto. Certifique-se de que um dos sítios de restrição só existe na região de inserção e o outro local de restrição existe apenas uma vez no vector de VIH-1, do lado de fora da região de inserção. Digest, pelo menos, 300 ng de DNA plasmídico num volume de reacção final de 10 ul. Escolha de tampões de restrição, temperatura de incubação e tempo de incubação de acordo com o protocolo dos enzimas de restrição seleccionadas do fabricante. Aqui 9 ul do DNA e electroforese em gel de execução digerido tal como descrito no passo 1.1.4. Escolha plasmídeos recombinantes que têm as bandas de ADN com os tamanhos previstos. Confirmar a integridade da sequência dos plasmídeos recombinantes por seqüenciamento Sanger. Embora raro, indesejadomutação (ões) pode ser introduzida durante as reacções de PCR. Sequência de ambas as cadeias do DNA de plasmídeo. Siga as instruções no passo 1.1.1.1 para projetar primers de seqüenciamento. Além disso, garantir que a frente e para os iniciadores de sequenciação reversa recozimento pelo menos 50 pb a montante e a jusante da região de inserção no plasmídeo recombinante, respectivamente. Enviar DNA plasmídeo e iniciadores de sequenciação para um provedor de serviço de sequenciação de ADN comercial. Prepare a amostra de ADN e iniciadores tal como especificado pelo fornecedor de serviços. Realizar uma livres de endotoxina do DNA de plasmídeo mutagenizado utilizando um kit de ADN plasmídeo de endotoxina livre de acordo com o protocolo do fabricante. Preparar pelo menos 1 ug de DNA do plasmídeo livre de endotoxina para a transfecção no passo seguinte. 1.3) Introduzir escala pequenas mutações Via-Site dirigido mutagênese Projete iniciadores mutagénicos com sobreposição de frente e iniciadores contendo o desejado reverter mutatiónica (s). Posicionar a base (s) a ser substituído, inserido ou eliminado no meio dos iniciadores, flanqueado por 10-15 bases homólogas. Siga as instruções na etapa 1.1.1.1. Use PCR para sintetizar plasmídeos mutantes. Para cada reacção de PCR, utilizar tampão de alta fidelidade 1x, 10 mM dNTPs, 2 U de polimerase de DNA de alta fidelidade, 0,5 pM de iniciador mutagénico para a frente, 0,5 pM de iniciador mutagénico inverso e 50 ng de pNL4-3VifB quimérico, a partir do passo 1.2.6 , num volume final de 50 ul. Definir os parâmetros dos ciclos térmicos a: 98 ° C durante 30 seg, 25 ciclos a 98 ° C durante 10 seg, 48 ° C durante 1 min e 72 ° C durante 10 min, seguido de 72 ° C durante 10 min. Repita o passo 1.2.2 para 1.2.6. 2. Geração de Viral da Usando Transfection Calcular a quantidade de estoque desejado e plasmídeo de DNA viral necessária. Com um título virai de 10 4 UI / ml ou superior, 1,8 ml de estoque viral é suficiente para dois conjuntos de assa competição crescimentoys, incluindo monoinfections, cada um feito em triplicado. Para uma transfecção feito de uma placa de 6 poços, cerca de 1,8 ml de sobrenadante é colhido por poço. Um? G de DNA de plasmídeo é necessário para cada transfecção feito de uma placa de 6 poços. Para cada poço de uma placa de 6 poços, 100 ul de preparar mistura de transfecção, por exemplo., Que consiste em 1 uL de X-tremeGENE 9 reagente de transfecção (ou produto semelhante), 1 ug de ADN plasmídeo e DMEM isento de soro. Determinar o volume de ADN plasmídeo necessário, usando 1 ug de ADN de plasmídeo por poço. Certifique-se de que a concentração final do ADN de plasmídeo é de pelo menos 50 ng / ul. Determinar quanto é necessário meio isento de soro (DMEM) por poço usando a fórmula: Volume total de DMEM em ul = 100 ul – DNA de volume em ul. Adiciona-se 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) células / cavidade em 2 ml de meio de propagação (DMEM + 10% de soro fetal de bovino (FBS)) em uma placa de 6 poços. Incubar durante 1 hora a 37 ° C numa5% de CO2. Semente como muitos poços, conforme necessário (determinado no passo 2.1). Para preparar a mistura de transfecção, a alíquota volume apropriado de meio DMEM isento de soro, tal como calculado acima, para um tubo de microcentrífuga de 1,8 ml de polipropileno, e, em seguida, adicionar o reagente de transfecção. Pipeta reagente directamente na solução de meios, não adicioná-lo à superfície plástica do tubo de microcentrífuga. Adicionar DNA plasmídeo passada. Pipeta cima e para baixo suavemente para misturar a solução. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente (15 ° C a 25 ° C) para permitir a formação de complexos de transfecção. Adicionar a mistura de uma maneira gota a gota a células cultivadas em placas de 6 poços. Agite ou rodam os poços para assegurar uma distribuição de complexos de transfecção. Placas de vedação com filme plástico. Incubar as culturas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 48 horas. Usar uma pipeta para recolher e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de 15 ml atragh um top 0,22 nm. Usar uma pipeta para transferir 250 ul ou mais do sobrenadante filtrado para tubos de microcentrífuga de 1,8 ml com juntas de borracha nas tampas. Loja sobrenadantes filtrado a -80 ° C até à sua utilização. 3. Determine Infecciosas Titer de Ações virais em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) Estimular PBMC com fito-hemaglutinina (PHA). Por um estoque virai, semente de 2 x 10 6 PBMC em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove completo (cIMDM; IMDM suplementado com 20 U / ml de interleucina humana 2 (hIL-2), 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina) suplementado com PHA (1,5 ng / mL). PBMC de sementes a 2 x 10 6 células / ml. Incubar PBMC a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 72 h. Colheita PBMC estimulados com PHA. Transferência não-aderente de PHA-PBMC para um tubo de 50 ml. Rotação do tubo a 228 xg durante 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem disrupting o sedimento celular. Re-suspender o sedimento de células até uma concentração final de 2 x 10 5 PBMC / ml em cIMDM. Semente de 2 x 10 4 PBMC estimulados com PHA / poço em 100 ul / cavidade em uma parte inferior cIMDM placa de 96 poços redondos. Fazer uma diluição de 1:10 do estoque virai. Em seguida, a partir do primeiro banco diluído, fazer doze diluições em série de 3 vezes de uma placa mestra de 96 cavidades. Este esquema de diluição é recomendada para a detecção de títulos virais no intervalo de abril 10-junho 10 unidades infecciosas (UI) por ml. Por exemplo, adicionar 20 ul de estoque de vírus a 180 ul de meios de comunicação no tubo de 1,5 ml. Misture a diluição pipetando cuidadosamente. Em seguida, transferir 90 ul do estoque diluído em 180 mL de mídia do primeiro poço e misture bem por pipetagem. Continue a série de diluição por transferência de 90 uL de um poço de corrente para 180 ul mídia no poço seguinte mais onze vezes. Aumentar ou diminuir a diluição inicial se títulos superiores a 10 6 UI / mlou inferior a 10 UI / ml 4 são esperados, respectivamente. Adicionar 40 ul de estoque virai diluída em série a partir da placa mestre de diluição na placa semeada PBMC (a partir do passo 3.3) em quadruplicado. Incubar as placas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 16-24 horas. Remover cuidadosamente 100 ul do sobrenadante de cada poço, e substituir com 160 ul de cIMDM fresca para um volume total de 200 ul / poço. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO2 (dia 1). Nos dias 4, 7, 10 e 13 de transferência de 100 ul de sobrenadante de cada poço para 100 ul de tampão de disrupção (2% Triton X-100 em PBS), e substituir com 100 ul de cIMDM fresco. Armazenar os sobrenadantes a -20 ° C. Manter a amostragem e adicionando cIMDM fresco a cada três dias até o título estabilizar. Determinar a dose infecciosa de cultura de tecidos de 50% (TCID 50) de a reserva viral p24 por ELISA, utilizando o dia 7 e 13 amostras, tal como descrito no passo 4. Se a TCID 50 obtido a partir do dia 13 é claramente mais elevado do que o título a partir do dia 7, o stock de virus pode necessitar de mais tempo para se expandir. Repetir o ELISA p24 utilizando amostras posteriores até os títulos infecciosos a partir de dois pontos de tempo de amostragem tornar-se estável (ou diminuição). Selecione os stocks de amostras com títulos mais elevados. 4. ELISA (Enzyme-linked Ensaio imunoabsorvente) Detecção de HIV-1 p24 para determinar virais infecciosas Titer NOTA: O protocolo seguinte foi desenvolvido usando placas de captura de antigénio de p24 preparados no nosso laboratório 30. Comercial do HIV-1 de placas de ELISA de p24 / kits podem também ser utilizados, seguindo o protocolo do fabricante. Antes de trabalhar com amostras, preparar stocks de trabalho de anticorpo primário (de coelho anti-HIV-1 SF2 p24 anti-soro). Anti-soro p24 Thaw na RT. Misturar 2,5 ml de glicerol com 2 ml de 10% de FBS em phosphatsalina e tampão (PBS). Adicionar 0,5 ml de anti-soro e misture. Loja 1 mL de alíquotas a -20 ° C. Descongele as amostras a partir do passo 3.7 em um 37 ° C incubadora. Lavar a placa de captura de p24, 5 vezes com tampão de lavagem (1x PBS com 0,05% de Tween-20). Adicionar 50 ul / poço de diluente de amostra (1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,2% de Tween-20 em meio RPMI-1640), em seguida, adicionar 50 ul de amostra aos poços apropriados. Inclua pelo menos três poços com diluente de amostra apenas como controles simulados / negativos. Incubar durante 2 horas a 37 ° C ou O / N a 4 ° C. Preparar a solução de anticorpo primário fresco antes da utilização. Fazer uma diluição 1: 2000 de diluição dobra do anticorpo primário estoques de trabalho usando o diluente de anticorpo primário (12% de FBS em meio RPMI-1640). Assegurar a preparar o suficiente para o uso da solução de 100 ul por cada amostra / controlo poço numa placa de 96 poços. Por exemplo, para fazer a solução suficiente para uma placa de 96 poços, adicionam-se 5 ul do anticorpo primário que trng estoques para o diluente de anticorpo primário para um volume final de 10 ml. Lavar placa de captura de 5 vezes com tampão de lavagem. Adicionar 100 ul da solução de anticorpo primário em cada poço. Incubar durante 1 h a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. Preparar a solução de anticorpo secundário fresco antes da utilização. Fazer uma diluição 1: 14.400 vezes a diluição do anticorpo secundário (1 mg / ml de anticorpo de cabra anti-coelho HRP) usando o diluente de anticorpo secundário (7% de FBS, 0,01% de Tween-20 em meio RPMI-1640). Para reduzir erros de pipetagem, execute uma diluição em série de duas etapas. Assegurar a preparar o suficiente para o uso da solução de 100 ul por cada amostra / controlo poço numa placa de 96 poços. Por exemplo, para fazer a solução suficiente para uma placa de 96 cavidades, primeiro adicionar 1 ml de anticorpo secundário de 99 uL de diluente de anticorpo secundário. Em seguida, adicionar 70 ul de diluição para o primeiro diluente anticorpo secundário para um volume final de 10 ml. Lavar a placa de captura de 5 times com tampão de lavagem. Adicionar 100 ul da solução de anticorpo secundário em cada poço. Incubar durante 1 hora a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. Lavar a placa 5 vezes com tampão de lavagem. Adicionar 100 ul de substrato TMB RT. Incubar 30 minutos à temperatura ambiente num recipiente fechado para proteger da luz. Adicionar 100 ul de solução de paragem TA (1 NH 2 SO 4). Ler a absorvância a 450-650 nm em cada poço utilizando um leitor de microplacas. Use o valor de absorção de marcar cada um bem como infectado ou não infectado. Considere um poço para conter vírus infecciosos se o valor de absorção é, pelo menos, três vezes maior do que o valor lido a partir de poços de controlo simuladas / negativo. Calcule TCID50 do estoque viral utilizando o método de Reed-Meunch 31. 5. Estabelecer cinética de crescimento viral 5.1) monoinfecção Semente de 3 x 10 5 PBMC estimuladas com PHA / poço em placas de 48 poçoss num volume total de 500 ul / poço. Manter as placas de cultura a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% até que a inoculação. Para cada um dos vírus, preparar um inoculo contendo 6000 UI, em 2 ml de cIMDM. Inocular poços em triplicado, através da adição de 500 uL do inoculo (1500 UI) para as células semeadas. O volume final da cultura de células infectada é de 1 ml / poço e a MOI é 0,005. Alíquota de 200 ul do inoculo remanescente para cada uma das duas placas de 96 poços para o isolamento de ARN, um dos quais é guardado como uma cópia de segurança. Incubar as culturas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 16-24 horas. Lavar as culturas 16-24 h após a inoculação. Remova e descarte 750 ul de sobrenadante de cultura. Adicionar 750 ul de cIMDM fresco. Embrulhe em filme plástico placas e centrifugação durante 10 minutos a 300 x g. Remova e descarte 750 sobrenadante ul. Adicionar 750 ul de cIMDM fresco. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 emmosphere (dia 1). Amostra culturas diárias do dia 2 ao dia 7. Transferir 500 mL de sobrenadante da cultura para um tubo de centrífuga de 1,8 ml. Rotação durante 1 minuto a 3000 x g. Transferir 200 ul do sobrenadante isento de células para as duas placas de 96 poços de amostra para o isolamento de ARN, uma vez mais poupando uma placa como cópia de segurança. Os sobrenadantes armazenar a -80 ° C até o isolamento do ARN. Adicionar cIMDM 500 ul fresco para cada cultura. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. Descartar culturas em Wescodyne no final da experiência. Isolar o ARN a partir de 200 ul de sobrenadante (uso de kits comerciais tais como QIAamp Viral RNA mini kit) seguindo o protocolo padrão do fabricante. Para um grande número de amostras, utilizar o Qiagen QIAxtractor. As amostras de RNA armazenar a -80 ° C, até a síntese de cDNA. 5.2) de síntese de ADNc (transcrição reversa) Para cada ARN samplo, adicionar 1,2 nmol de dNTP e 1,2 pmol de iniciador de síntese de ADNc, (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nucleótidos 7968-7995) a 10 ul de ARN viral. Adicionar água para um volume final de 14 ul. Flick o tubo para misturar e girar rapidamente para recolher o líquido na parte inferior do tubo. Incubar mistura durante 5 min a 65 ° C, em seguida, manter a 4 ° C até a mistura principal é preparado. Preparar a mistura mestra usando 5x tampão de primeira cadeia (250 mM de Tris-HCl, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM), DTT 5 mM, 120 U de SuperScriptIII e 240 U de inibidor de Rnase. Adicionar água para um volume final de 10 ul. Adicionar 10 ml de mistura principal a mistura RNA, passe o dedo para misturar e girar para coletar. Incubar mistura durante 90 min a 50 ° C para permitir a síntese de ADNc. Incubar durante 15 min a 70 ° C para inactivar a transcriptase reversa. Manter a 4 ° C conforme necessário. Adicionar 2 U de RNase H, passe o dedo para misturar, e depois girar para coletar. Incubar 20 mina 37 ° C. ADNc Armazenar a -20 ° C. 5.3) A quantificação de ADNc Utilizando Sistema qPCR Prepara-se uma série de diluições padrão. Faça 10 vezes diluição em série, a partir de 3 x 10 6 cópias / mL até 30 cópias / mL, de pNL4-3VifA. Use água destilada para diluições. Preparar diluições em série do padrão fresco antes da utilização ou preparar pequenos lotes e manter a -20 ° C. Não congelar-descongelar as normas mais do que três vezes. Configurar uma placa de 96 poços de reacção qPCR. Certifique-se de que cada placa contém pelo menos um poço de controlo negativo, um triplicado da série de diluições do padrão, e pelo menos um duplicado de cada amostra de cDNA. Para cada reacção de qPCR, usar 12,5 ul de qPCR mistura principal, 0,2 uM de sonda, 0,8 uM de cada um dos iniciadores directo e inverso, e 1 ul de ADNc ou a série de diluição padrão ou de água / tampão (para o poço de controlo negativo). Adicionar água para um volume final de 25 ul. A sonda qPCR é leve sensível. Mantenha-o em recipiente fechado. Para detectar ADNc derivada do clone molecular baseada pNL4-3VifA, utilizar o Vifa iniciador-sonda: VifAB iniciador directo (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), Vifa iniciador reverso (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') e sonda VifAB (6FAM-5'-3-CTCCATTCTATGGAGACTC '-MGBNFQ). Para ADNc derivada do clone com base pNL4-3VifB, utilizar o VifB iniciador-sonda: VifAB iniciador directo, sonda VifAB e VifB iniciador reverso (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Definir os parâmetros dos ciclos de PCR a 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, e 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Consulte o documento de suporte do fabricante para o funcionamento da máquina qPCR. Calcular uma curva padrão, utilizando os dados do padrão de séries de diluição em triplicado. Comparar os dados de amplificação do ADNc da amostra com a curva padrão para determinar o número de cópias. Consulte o documento de suporte do fabricante para daprocessamento ta. 5.4) Determinar viral fase de crescimento exponencial Traçar cinética de crescimento viral com o dia de amostragem ao longo do eixo X e do número de cópias de ADNc ao longo do eixo Y e identificar a fase exponencial de crescimento virai, isto é., Quando ADNc virais copiar números de aumento de uma progressão exponencial. Use a ferramenta da web GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) para calcular a taxa de crescimento viral (g). Nesta aplicação, a ferramenta GRC aceita ADNc copiar números de, pelo menos, dois pontos de tempo como entrada, e gera a taxa de crescimento viral (g). Utilizar apenas os dados de ponto de tempo dentro da fase de crescimento exponencial (ver o passo 5.4.1, supra) para se obter as taxas de crescimento precisos. Para uma descrição detalhada do modelo matemático utilizado na ferramenta da web GRC, ver 20. 6. Crescimento ensaio de competição Semente de 3 x 10 5 </ Sup> PBMC estimulados com PHA (ou 1 x 10 5 células CEMx174) em 500 ul de volume total por poço numa placa de fundo plano de 48. Mantenha a placa em 37 ° C em atmosfera de CO2 a 5% até que a inoculação. Para cada um dos vírus, preparar 3 ml de inoculo contendo 6000 UI. Transferir 1,5 ml de cada inoculo virai para um tubo estéril para criar o inoculo infecção dupla. Adicionar 500 ul da dupla inoculo (1500 UI) de 3 x 10 5 células em uma placa de 48 poços. O volume de cultura final é de 1 ml / poço. Alíquota de 200 ul do inoculo a duas placas de 96 poços para o isolamento do ARN; salvar uma placa como um back-up. Incubar as células inoculadas a 37 ° C com uma atmosfera de CO2 a 5% durante 16-24 horas. Lavar as culturas 16-24 h após a inoculação. Remova e descarte 750 ul de sobrenadante de cultura. Adicionar 750 ul de cIMDM fresco. Enrole em placas de plástico e centrifugação durante 10 min a 300 x g. Remova e descarte 75081; l sobrenadante. Adicionar 750 ul de cIMDM fresco. Incubar a 37 ° C com uma atmosfera de CO2 a 5% (1 dia). Seleccionar tempos de amostragem para incluir, pelo menos, três pontos de tempo dentro da fase exponencial de crescimento observado no passo 5.4.1. Para cada amostragem, siga o passo 5.1.7. Realizar a síntese de cDNA como descrito na seção 5.2. Determinar a proporção variante viral utilizando qPCR. Prepara-se uma série padrão de diluição em série em triplicado, diluição de 10 vezes em cada passo a partir de 3 x 10 6 cópias / ul de 30 cópias / mL de pNL4-3VifA. Configurar uma placa de 96 poços de reacção qPCR. Certifique-se de que cada placa contém, pelo menos, um controlo negativo, a série de diluição padrão em triplicado, e duplicados de cada amostra de cDNA. Para cada reacção de qPCR, usar 12,5 ul de qPCR Master Mix, 0,2 uM, 0,8 uM sonda de cada um dos iniciadores directos e inversos e 1 ul de ADNc ou o padrão d série ilution ou água / tampão (para os poços de controlo negativo). Adicionar água para um volume final de 25 ul. A sonda qPCR é sensível à luz, mantenha-o em recipiente fechado. Use o iniciador-sonda para detectar sinais Vifa nos controlos negativos e as séries de diluições do padrão e com uma duplicata da amostra cDNA. Use o iniciador-sonda VifB com o outro duplicado da amostra cDNA. Definir os parâmetros dos ciclos de PCR a 50 ° C durante 2 min, depois 95 ° C durante 10 min, e em seguida 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Consulte o documento de suporte do fabricante para o funcionamento da máquina qPCR. Calcula-se a curva padrão, utilizando dados de amplificação a partir da série de diluições padrão. Comparar os dados de amplificação das amostras de ADNc com a curva padrão para determinar o número de cópia. Consulte o documento de suporte do fabricante para processamento de dados. Use a ferramenta da web GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) para calcular a aptidão viral relativa (d). NOTA: A ferramenta GRC aceita ADNc copiar números ou alturas de pico de cromatograma de, pelo menos, dois pontos de tempo como a entrada, e produz a diferença de taxa de crescimento líquido (d) entre os dois vírus. Enquanto a ferramenta pode calcular a taxa de crescimento líquido de dois dados de ponto de tempo, recomenda-se fortemente a entrada de dados a partir de três ou mais pontos de tempo. Utilizar apenas os dados obtidos a partir de pontos de tempo dentro da fase de crescimento exponencial (ver passo 5.4) para se obter as taxas de crescimento precisos. Para uma descrição detalhada do modelo matemático utilizado na ferramenta da web GRC, ver 20. Determinar os rácios virais utilizando chromatogram pico-alturas Amplificar por PCR de HIV-1 vif fragmentos contendo o marcador de sequência VifAB usando VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 posiciona 5266-5291) e VifRev iniciadores (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 posições 5579-5553). Para cada reacção de PCR, usar 1 ul de ADNc, 1x tampão de NH 4, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, 2,5 U de Taq polimerase, e 0,45 uM de cada iniciador. Adicionar água para um volume final de 50 ul. Definir os parâmetros dos ciclos de PCR a 3 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, e 70 ° C durante 1 min, seguido de 34 ciclos a 94 ° C durante 15 seg, 58 ° C durante 30 seg, e 70 ° C durante 1 min, e, em seguida, manter a 4 ° C. Purifica-se os produtos de PCR utilizando o kit de purificação de PCR QIAquick de acordo com o protocolo do fabricante. Enviar produtos de PCR purificados a um prestador de serviços de seqüenciamento de DNA para sequenciamento Sanger. Verifique a pontuação média a qualidade da leitura, que deve ser fornecido pelo serviço de sequenciamento. Se a precisão média chamada base é inferior a 85%, refazer passo 6.10.1 a 6.10.3 Use a ferramenta da web ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) para calcular proporção viral em cada ponto de tempo. A ferramenta exige que o ficheiro de sequência de rastreio (* .ab1) e a sequência 5 'para o local de nucleótidos de interesse. A ferramenta mede a intensidade do pico no local especificado. A razão entre a intensidade de pico corresponde à ração dos dois vírus (Figura 4B). Utilizar a ferramenta da web GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) e as intensidades de pico registadas como entrada para calcular a aptidão relativa viral (d). Veja o passo 6.10.6. 20