Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l'immunodéficience humaines

REMARQUE: Le protocole, tel que décrit ci-dessous, ne comprend aucune information identifiable patient et est donc pas considéré comme des sujets humains de la recherche par l'Université de Washington institutionnelle Conseil d'examen ou la Division des sujets humains. 1. Construction d'chimérique VIH-1 NL4-3 clones moléculaires 1.1) Amplify Insérer fragment d'ADN Concevoir des amorces chimériques. Moitiés 5 'des deux amorces sens et antisens contiennent une séquence de vecteur VIH-1, au cours de laquelle le fragment sera inséré. La moitié 3 'des amorces doivent contenir la fin de la séquence d'insertion (figure 2). Assurez-vous que la séquence de l'amorce chimère conserve les cadres ouverts de lecture originales. Utilisation des amorces d'au moins 20 bases de longueur, avec une température de fusion supérieure ou égale à 60 ° C, ~ 50% de teneur en GC, et une faible tendance à former des dimères d'amorces, des hétérodimères et / ou des structures en épingle à cheveux. Évaluer ces propriétésl'aide de l'outil Web OligoAnalyzer ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Utilisation PCR et les 27 amorces chimères pour amplifier l'ADN d'insertion (figure 2). Pour chaque réaction PCR, utiliser 1X tampon de haute fidélité, 0,2 mM de dNTP, 1 U de la haute fidélité de l'ADN polymérase, 0,5 M de amorce chimère avant, 0,5 M de amorce chimère inverse, et 1 PG0 ng d'échantillon d'ADN portant région d'insertion. Ajouter dH 2 O pour obtenir un volume final de 50 ul. Réglez étapes thermiques de cyclisme comme suit: Effectuez une étape initiale de dénaturation à l'ADN 98 ° C pendant 10 sec. Amplifier par 30 cycles de dénaturation d'ADN à 98 ° C pendant 10 s et hybridation à l'ADN de 3 ° C au-dessus de la plus basse température de fusion des deux amorces pendant 20 s. Effectuez une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. Boutique produits de PCR à 4 ° C. Prendre 5 pi des produits de PCR à partir de laétape précédente et exécuter gel d'agarose électrophorèse 28. Utilisez un gel à 0,7% d'agarose, un tampon TAE 1X (40 mM Tris-acétate, 1 mM d'EDTA), 0,5 pg / ml de bromure d'éthidium (EtBr) et une concentration finale de 1 kb ladder comme marqueur de taille d'ADN. Ensemble tension de source d'alimentation à 5 V / cm de distance entre les électrodes. Arrêter l'électrophorèse lorsque le colorant de charge migre par environ 2/3 de la longueur du gel. Visualisez du gel en utilisant un système de documentation de gel 28. NOTE: EtBr est soupçonné d'être cancérigène et doit être correctement éliminés, conformément aux règlements de l'institution. Les gants doivent toujours être portés lors de la manipulation des gels contenant EtBr. Changez de nouveaux gants après EtBr de manutention de matériaux contenant de finition et avant de manipuler d'autres matériaux ou d'équipements pour prévenir la contamination croisée. Si une seule bande d'ADN correspondant à la taille du produit de PCR souhaité est détecté, le reste de purifier le produit de PCR en utilisant un kit commercial tel que le QIAquick PCR Purification Kit accordment aux protocoles du fabricant. Si d'autres bandes non spécifiques sont également présents, utiliser le reste du produit de PCR afin de fonctionner électrophorèse sur gel préparatif. Utilisez les mêmes paramètres et les conditions spécifiées à l'étape 1.1.4. Assurez-vous que le puits de gel est suffisamment grande pour charger ~ 45 pi de produits de PCR. Découper la bande d'intérêt et extraire l'ADN à partir du gel en utilisant le kit d'extraction QIAquick gel selon les protocoles du fabricant. 1.2) Introduire le fragment d'insertion en pleine longueur infectieuses VIH-1 sous-type B Vector (pNL4-3) Utilisation des produits de PCR purifiés de l'étape 1.1.5 en tant qu'amorces de PCR. Utilisez pNL4-3VifA 20 comme matrice d'ADN dans une réaction PCR et utiliser pNL4-3VifB 20 comme matrice dans l'autre réaction (Figure 2). Pour chaque réaction PCR, en utilisant un tampon de haute fidélité 1x, 0,2 mM de dNTP, 2 U d'ADN polymerase haute fidélité, 500 ng d'amorce d'ADN et 50 ng d'ADN matrice dans un volume finaleume de 50 pi. Régler les paramètres de cyclage thermique à 98 ° C pendant 30 sec, 35 cycles à 98 ° C pendant 10 sec, 48 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 10 min, suivi par 72 ° C pendant 10 min. Ajouter 10 U de Dpn I à 50 ul de la réaction de PCR et incuber à 37 ° C pendant 1 heure pour digérer l'ADN de matrice. Assurez-vous que l'ADN plasmidique est isolé à partir d'une méthylation de la souche bactérienne compétente, par exemple., Escherichia coli TOP10 chimiquement compétentes. Utiliser Dpn I digéré produit à transformer des cellules bactériennes compétentes. Utilisez transformation de choc thermique avec TOP10 chimiquement compétentes E. coli, selon le protocole du fabricant. Pour sélectionner les cellules bactériennes contenant le plasmide recombinant, utilisez du bouillon de Luria (LB) des plaques de culture contenant 100 mg / l de carbénicilline. Choix ~ 10 colonies bien séparées et cultiver séparément chacun dans 3 ml de milieu liquide LB contenant 100 mg / l de carbénicilline et incuber à 30 ° C dans unshaker O / N. Utilisation QIAprep Spin Miniprep Kit pour isoler l'ADN plasmidique à partir de la culture bactérienne liquide, selon le protocole du fabricant. Utiliser le double digestion de restriction 29 pour déterminer si l'ADN plasmidique contient l'insert correct. Assurez-vous que l'un des sites de restriction existe uniquement dans la région de l'insert et l'autre site de restriction existe une seule fois dans le vecteur du VIH-1, à l'extérieur de la région d'insertion. Digest au moins 300 ng d'ADN de plasmide dans un volume réactionnel final de 10 ul. Sélectionner les tampons de restriction, la température d'incubation et le temps d'incubation selon le protocole du fabricant des enzymes de restriction choisies. Prenez 9 pi de la électrophorèse de l'ADN et le gel de l'exécution digéré comme décrit à l'étape 1.1.4. Sélectionner les plasmides recombinants qui ont des bandes d'ADN de la taille prédite. Confirmer l'intégrité de la séquence des plasmides recombinants par séquençage de Sanger. Bien que rare, non désirésmutation (s) peut être introduit au cours des réactions PCR. Séquence les deux brins de l'ADN plasmidique. Suivez les instructions à l'étape 1.1.1.1 pour concevoir des amorces de séquençage. En outre, en sorte que la marche avant et arrière des amorces de séquençage recuit d'au moins 50 pb en amont et en aval de la région d'insertion dans le plasmide recombinant, respectivement. Soumettre un ADN plasmidique et des amorces de séquençage à un fournisseur de services de séquençage d'ADN du commerce. Préparer l'échantillon d'ADN et d'amorces tel que spécifié par le fournisseur de services. Faire une image libre endotoxine de l'ADN du plasmide muté en utilisant un kit d'ADN plasmidique sans endotoxine selon le protocole du fabricant. Préparer au moins 1 ug d'ADN de plasmide exempt d'endotoxine pour la transfection dans l'étape suivante. 1.3) Présentez à petite échelle mutations Via mutagenèse dirigée Concevoir des amorces mutagènes qui se chevauchent amorces sens et antisens contenant l'mutat souhaitéeion (s). Positionner la base (s) d'être substitués, insérés ou supprimés dans le milieu des amorces, flanqué de 10 à 15 bases homologues. Suivez les instructions à l'étape 1.1.1.1. Utilisation PCR pour synthétiser des plasmides mutants. Pour chaque réaction PCR, en utilisant un tampon de haute fidélité 1x, 10 mM des dNTP, 2 U d'ADN polymerase haute fidélité, 0,5 uM de l'amorce mutagene directe, 0,5 uM de l'amorce mutagene inverse et 50 ng de pNL4-3VifB chimérique, provenant de l'étape 1.2.6 , dans un volume final de 50 ul. Régler les paramètres de cyclage thermique à 98 ° C pendant 30 sec, 25 cycles à 98 ° C pendant 10 sec, 48 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 10 min, suivi par 72 ° C pendant 10 min. Répétez l'étape 1.2.2 à 1.2.6. 2. Génération de Viral Stock Utilisation transfection Calculez le montant des virale stock souhaité et le plasmide ADN requis. Avec un titre viral de 10 4 UI / ml ou plus, 1,8 ml de stock virale est suffisante pour deux séries de compétition de croissance assays, y compris monoinfections, fait chacun en trois exemplaires. Pour une transfection fait dans une plaque à 6 puits, environ 1,8 ml surnageant est récolté par puits. Un pg d'ADN de plasmide est nécessaire pour chaque transfection effectuée dans une plaque à 6 puits. Pour chaque puits d'une plaque à 6 puits, 100 ul de la préparation du mélange de transfection, par exemple., Consistant en une pi X-9 tremeGENE réactif de transfection (ou un produit comparable), 1 pg d'ADN de plasmide et du DMEM exempt de sérum. Déterminer le volume de l'ADN plasmidique nécessaire, en utilisant 1 pg d'ADN plasmidique par puits. Assurez-vous que la concentration finale de l'ADN de plasmide est d'au moins 50 ng / ul. Déterminer la quantité de milieu exempt de sérum (DMEM) est nécessaire par puits en utilisant la formule: Volume total de DMEM dans 100 ul ul = – volume de l'ADN dans ul. Ajouter 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) cellules / puits dans 2 ml de milieu de propagation (DMEM + 10% de sérum bovin fœtal (FBS)) dans une plaque à 6 puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans unAtmosphère de 5% de CO 2. Ensemencer autant de puits nécessaire (déterminées à l'étape 2.1). Pour préparer le mélange de transfection, aliquoter le volume approprié de DMEM sans sérum, tel que calculé ci-dessus, dans un tube à centrifuger de 1,8 ml de polypropylène, puis ajouter le réactif de transfection. réactif pipette directement dans la solution des médias, ne pas ajouter à la surface plastique du microtube. Ajouter ADN plasmidique dernière. Pipet et doucement pour mélanger la solution. Incuber pendant 15 min à température ambiante (15 ° C à 25 ° C) pour permettre la formation de complexes de transfection. Ajouter le mélange d'une manière goutte à goutte à des cellules ensemencées dans la plaque à 6 puits. Secouer ou agiter les puits pour assurer une distribution uniforme des complexes de transfection doucement. plaques d'étanchéité avec une pellicule de plastique. Incuber les cultures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 48 heures. Utiliser une pipette pour recueillir et transférer le surnageant dans un tube de 15 ml soigneusement through un sommet de 0,22 um filtre. Utiliser une pipette pour transférer 250 pi ou plus du surnageant filtré à 1,8 ml des tubes de microcentrifugation de joints en caoutchouc dans les couvercles. Magasin filtré les surnageants à -80 ° C jusqu'à utilisation. 3. Déterminer infectieuses Titer des stocks viraux sur des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) Stimuler CMSP avec phytohémagglutinine (PHA). Par un stock virale, graine 2 x 10 6 CMSP en milieu de Dulbecco modifié complet d'Iscove (cIMDM; IMDM supplémenté avec 20 U / ml d'interleukine 2 humaine (hIL-2), 10% de sérum fœtal bovin et 1% de pénicilline / streptomycine) complétée avec de la PHA (1,5 pg / ml). CMSP de semences à 2 x 10 6 cellules / ml. Incuber PBMC à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 72 heures. Récolte PHA CMSP stimulées. Transfert non adhérente PHA-PBMC dans un tube conique de 50 ml. Spin le tube à 228 g pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant sans disrupting le culot cellulaire. Remettre en suspension le culot de cellules à une concentration finale de 2 x 10 5 / ml dans du PBMC cIMDM. Seed 2 x 10 4 PHA CMSP stimulées / puits dans 100 pl / puits cIMDM dans un plat rond de 96 puits à fond. Faire une dilution 1:10 du stock viral. Puis, à partir du premier stock dilué, faire douze dilutions en série de 3 fois dans une plaque de maître de 96 puits. Ce schéma de dilution est recommandé pour détecter les titres viraux dans la plage de 4 oct-6 oct unité infectieuse (UI) par ml. Par exemple, ajouter 20 pi de stock de virus à 180 pi médias dans le tube de 1,5 ml. Mélanger la dilution en pipetant soigneusement. Puis transférer 90 ul du stock dilué dans 180 médias ul du premier puits et bien mélanger par pipetage. Continuer la série de dilution en transférant 90 ul du puits actuel à 180 pi médias dans le prochain puits onze fois plus. Augmenter ou diminuer la dilution initiale si des titres plus élevés de 10 6 UI / mlou inférieure à 10 4 UI / ml sont prévus, respectivement. Ajouter 40 ul du stock viral dilué en série à partir de la plaque maître de dilution à la plaque CMSP tête de série (de l'étape 3.3) en quadruple. Incuber les plaques à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 16 à 24 heures. Retirez délicatement 100 pi de surnageant de chaque puits, et les remplacer par 160 pi de cIMDM frais pour un volume total de 200 pl / puits. Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO2 atmosphère (jour 1). Les jours 4, 7, 10 et 13 transfert 100 pi de surnageant de chaque puits à 100 tampon de rupture pi (2% de Triton-100 dans du PBS), et les remplacer par 100 pi de cIMDM frais. Rangez les surnageants à -20 ° C. Gardez l'échantillonnage et en ajoutant cIMDM frais tous les trois jours jusqu'à ce que le titre se stabilise. Déterminer la dose de 50% de la culture de tissus infectieux (DICT 50) du stock viral p24 par ELISA en utilisant le jour 7 et 13 échantillons comme décrit dans l'étape 4. Si le DICT 50 obtenue à partir de 13 jours est nettement plus élevé que le titre du jour 7, le stock de virus peut avoir besoin de plus de temps pour se développer. Répétez le p24 ELISA utilisant des échantillons plus tard jusqu'à ce que les titres infectieux de deux points dans le temps échantillonnage deviennent stables (ou diminution). Sélectionnez les stocks à partir d'échantillons avec les titres les plus élevés. 4. ELISA (Enzyme-linked immunoabsorbant Assay) de détection du VIH-1 pour la détermination de p24 virale infectieuse Titer REMARQUE: Le protocole suivant a été développé en utilisant des plaques de capture de l'antigène p24 préparés dans notre laboratoire 30. Commercial VIH-1 p24 plaque ELISA / kits peuvent également être utilisés, en suivant le protocole du fabricant. Avant de travailler avec des échantillons, préparer des stocks de travail de l'anticorps primaire (de lapin anti-VIH-1 p24 antisérum SF2). Thaw antisérum p24 à TA. Mélanger 2,5 ml de glycerol à 2 ml de 10% de FBS dans phosphate saline de tampon (PBS). Ajouter 0,5 ml de sérum et mélanger. Magasin 1 ml d'aliquotes à -20 ° C. Décongeler les échantillons de l'étape 3.7 dans un incubateur à 37 ° C. Laver la plaque de capture p24 5 fois avec un tampon de lavage (1x PBS avec 0,05% de Tween-20). Ajouter 50 ul / puits de tampon pour échantillon (1% d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,2% de Tween-20 dans du RPMI-1640), puis ajouter 50 ul d'échantillon dans les puits appropriés. Inclure au moins trois puits avec le diluant pour échantillons seulement comme des contrôles simulés / négatifs. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C ou O / N à 4 ° C. Préparer la solution d'anticorps primaire frais avant utilisation. Ajouter un 1: 2000 dilution de l'anticorps primaire stock de travail en utilisant le diluant d'anticorps primaire (12% de FBS dans du RPMI-1640). Assurez-vous de préparer suffisamment pour l'utilisation de la solution de 100 pi par chaque échantillon / contrôle d'un puits dans une plaque de 96 puits. Par exemple, pour faire suffisamment de solution pour une plaque de 96 puits, ajouter 5 pl de la worki d'anticorps primaireng actions au diluant d'anticorps primaire à un volume final de 10 ml. Laver la plaque de capture 5 fois avec un tampon de lavage. Ajouter 100 ul de la solution d'anticorps primaire à chaque puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Préparer la solution d'anticorps secondaire frais avant utilisation. Ajouter un 1: 14 400 fois la dilution de l'anticorps secondaire (1 mg / ml de chèvre anti-lapin HRP) à l'aide du diluant d'anticorps secondaire (7% de FBS, 0,01% de Tween-20 dans du RPMI-1640). Pour réduire les erreurs de pipetage, effectuer une dilution en série en deux étapes. Assurez-vous de préparer suffisamment pour l'utilisation de la solution de 100 pi par chaque échantillon / contrôle d'un puits dans une plaque de 96 puits. Par exemple, pour faire suffisamment de solution pour une plaque de 96 puits, d'abord ajouter 1 pl de l'anticorps secondaire 99 pi du diluant d'anticorps secondaire. Ensuite, ajouter 70 pi de dilution de la première diluant d'anticorps secondaire pour un volume final de 10 ml. Laver la plaque de capture 5 times avec le tampon de lavage. Ajouter 100 ul de la solution d'anticorps secondaire dans chaque puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Laver la plaque 5 fois avec le tampon de lavage. Ajouter 100 pi de substrat TMB RT. Incuber 30 minutes à température ambiante dans un récipient fermé à l'abri de la lumière. Ajouter 100 ul de solution d'arrêt RT (1 NH 2 SO 4). Lire l'absorbance à 450-650 nm dans chaque puits en utilisant un lecteur de microplaques. Utilisez la valeur d'absorbance de marquer ainsi que chaque infecté ou non infecté. Envisager un puits pour contenir le virus infectieux si la valeur d'absorbance est au moins trois fois plus élevé que la valeur lue dans simulacres / négative puits de contrôle. Calculer DICT 50 du stock viral en utilisant la méthode de Reed-Meunch 31. 5. Mettre en place la cinétique de croissance virale 5.1) mono-infection Seed 3 x 10 5 PHA stimulée PBMC / puits dans 48 puits plaques dans un volume total de 500 pl / puits. Gardez les plaques de culture à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5% jusqu'à ce que l'inoculation. Pour chaque virus, préparer un inoculum contenant 6000 UI dans 2 ml de cIMDM. Inoculer des puits en triple exemplaire, en ajoutant 500 pi de l'inoculum (1500 UI) pour les cellules ensemencées. Le volume final de la culture cellulaire infectée est de 1 ml / puits et le MOI est de 0,005. Aliquote de 200 pi de l'inoculum restant à chacune des deux plaques à 96 puits pour l'isolement de l'ARN, dont l'un est enregistré comme une sauvegarde. Incuber les cultures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 16 à 24 heures. Laver les cultures 16-24 h après l'inoculation. Retirez et jetez 750 pi de surnageant de culture. Ajouter 750 pi de cIMDM frais. Enveloppez plaques dans une pellicule de plastique et de spin pendant 10 minutes à 300 x g. Retirez et jetez 750 surnageant ul. Ajouter 750 pi de cIMDM frais. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 àmosphere (jour 1). Cultures exemples quotidiens du jour 2 au jour 7. Transférer 500 ul de surnageant de culture dans un tube de 1,8 ml de la centrifugeuse. Spin pendant 1 min à 3000 x g. Transfert 200 pi du surnageant acellulaire aux deux plaques d'échantillons à 96 puits pour l'isolement de l'ARN, sauvant à nouveau une plaque de sauvegarde. Les surnageants de conserver à -80 ° C jusqu'à l'isolement de l'ARN. Ajouter cIMDM 500 pi frais à chaque culture. Incuber à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Jeter les cultures dans Wescodyne à la fin de l'expérience. Isoler l'ARN à partir de 200 pi de surnageant (utilisation de kits commerciaux tels que QIAamp Viral RNA Mini Kit) suivantes protocole standard du fabricant. Pour un grand nombre d'échantillons, utilisez le Qiagen QIAxtractor. Des échantillons d'ARN de conserver à -80 ° C jusqu'à ce que la synthèse d'ADNc. 5.2) Synthèse d'ADNc (Reverse Transcription) Pour chaque ARN deexemple, ajouter 1,2 nmoles de dNTP et 1,2 pmol d'amorce la synthèse d'ADNc, (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nucleotides 7968 à 7995) à 10 ul de l'ARN viral. Ajouter de l'eau jusqu'à un volume final de 14 ul. Flick le tube pour mélanger et centrifuger brièvement pour recueillir liquide au fond du tube. Incuber le mélange pendant 5 min à 65 ° C, puis maintenez à 4 ° C jusqu'à ce que le mélange maître est préparé. Préparer master mix en utilisant 5x premier brin tampon (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM de KCl, 15 mM MgCl 2), 5 mM de DTT, 120 U de SuperScriptIII et 240 U de RNase Inhibitor. Ajouter de l'eau à un volume final de 10 ul. Ajouter 10 pi de mélange maître au mélange d'ARN, film de mélanger et tourner à collecter. Incuber le mélange pendant 90 min à 50 ° C pour permettre la synthèse de l'ADNc. Incuber pendant 15 min à 70 ° C pour inactiver la transcriptase inverse. Maintenir à 4 ° C si nécessaire. Ajouter 2 U de RNase H, film pour mélanger, puis tourner à collecter. Incuber 20 minà 37 ° C. ADNc de magasin à -20 ° C. 5.3) ADNc quantification au moyen du Système qPCR Préparer une série de dilution standard. Faites 10 fois dilution en série, à partir de 3 x 10 6 copies / ul jusqu'à 30 copies / ul, de pNL4-3VifA. Utilisez de l'eau distillée pour les dilutions. Préparer la série de dilution standard frais avant utilisation ou préparer des petits lots et de garder à -20 ° C. Ne pas congeler-décongeler les normes plus de trois fois. Mettre en place un qPCR plaque de réaction de 96 puits. Assurez-vous que chaque plaque comporte au moins un puits de témoins négatifs, un trois exemplaires de la série de dilutions standard, et au moins un double de chaque échantillon d'ADNc. Pour chaque réaction qPCR, utiliser 12,5 pi de qPCR Master Mix, 0,2 uM sonde, 0,8 pm chacune des amorces avant et arrière et 1 pi de l'ADNc ou de la série de dilution standard ou eau / tampon (pour le contrôle négatif bien). Ajouter de l'eau jusqu'à un volume final de 25 ul. La sonde qPCR est la lumière sensibles. Gardez-le dans un récipient fermé. Pour détecter l'ADNc dérivé du clone moléculaire basée pNL4-3VifA, utilisez le VIFA sonde-amorce: VifAB amorce avant (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VIFA amorce inverse (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') et la sonde VifAB (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). Pour ADNc dérivé de clone basé pNL4-3VifB, utilisez le VifB sonde-amorce: VifAB amorce avant, sonde VifAB et VifB amorce inverse (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Définir les paramètres de cyclage de PCR à 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, et 40 cycles de 95 ° C pendant 15 sec et 60 ° C pendant 1 min. Consultez le document de support du constructeur pour le fonctionnement de la machine qPCR. Calculer une courbe standard en utilisant les données de la série de dilution standard triple. Comparer les données d'amplification de l'échantillon d'ADNc de la courbe d'étalonnage pour déterminer le nombre de copies. Consultez le document d'assistance du fabricant de datraitement ta. 5.4) Déterminer virale croissance exponentielle Phase Tracer la cinétique de croissance virales avec le jour d'échantillonnage le long de l'axe X et le nombre de copies d'ADNc le long de l'axe Y et identifier la phase exponentielle de croissance virale, à savoir., Lorsque le nombre de copies d'ADNc viraux une augmentation de la progression exponentielle. Utilisez l'outil de Web GRC ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) pour calculer le taux de croissance virale (g). Dans cette application, l'outil GRC accepte nombre de copies d'ADNc à partir d'au moins deux points dans le temps en entrée, et délivre en sortie le taux de croissance virale (g). Utilisez uniquement des données de point de temps dans la phase de croissance exponentielle (voir étape 5.4.1 ci-dessus) pour obtenir des taux de croissance précis. Pour une description détaillée du modèle mathématique utilisé dans l'outil Web GRC, voir 20. 6. Croissance Test de compétition Graine 3 x 10 5 </ Sup> PBMC stimulés par PHA (ou 1 x 10 5 CEMx174 cellules) dans 500 pi volume total par puits dans une plaque à fond plat 48. Gardez plaque dans 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5% jusqu'à ce que l'inoculation. Pour chaque virus, préparer 3 ml d'inoculum contenant 6000 UI. Transférer 1,5 ml de chaque inoculum viral dans un tube stérile pour créer la double infection inoculum. Ajouter 500 pi de la double inoculum (1500 UI) de 3 x 10 5 cellules dans une plaque de 48 puits. Le volume de culture final est de 1 ml / puits. Aliquoter 200 ul de l'inoculum à deux plaques à 96 puits pour l'isolement de l'ARN; enregistrer une plaque comme un retour. Incuber les cellules inoculées à 37 ° C avec une atmosphère de CO2 à 5% pendant 16 à 24 heures. Laver les cultures 16-24 h après l'inoculation. Retirez et jetez 750 pi de surnageant de culture. Ajouter 750 pi de cIMDM frais. Enveloppez plaques dans une pellicule de plastique et de spin pendant 10 min à 300 x g. Retirez et jetez 75081; l surnageant. Ajouter 750 pi de cIMDM frais. Incuber à 37 ° C avec une atmosphère de CO2 à 5% (jour 1). Sélectionnez périodes d'échantillonnage à inclure au moins 3 points de temps dans la phase de croissance exponentielle observée à l'étape 5.4.1. Pour chaque prélèvement, suivez l'étape 5.1.7. Effectuer la synthèse d'ADNc, comme décrit dans la section 5.2. Déterminer le rapport de variante viral en utilisant qPCR. Préparer une série de dilutions série standard en trois exemplaires, en diluant 10 fois dans chaque étape de 3 x 10 6 copies / ul à 30 ul de copies / pNL4-3VifA. Mettre en place un qPCR plaque de réaction de 96 puits. Veiller à ce que chaque plaque contient au moins un contrôle négatif, la série de dilution standard en trois exemplaires, et des doubles de chaque échantillon d'ADNc. Pour chaque réaction qPCR, utiliser 12,5 pi de qPCR Master Mix, 0,2 uM sonde, 0,8 pm chacune des amorces sens et antisens et 1 pi de l'ADNc ou le standard d Série ilution ou eau / tampon (pour les puits témoins négatifs). Ajouter de l'eau jusqu'à un volume final de 25 ul. La sonde qPCR est sensible à la lumière, le garder dans un récipient fermé. Utilisez la sonde-amorce VIFA pour détecter des signaux dans les contrôles négatifs et la série de dilution standard et avec un duplicata de l'échantillon d'ADNc. Utilisez la sonde-amorce VifB avec l'autre exemplaire de l'échantillon d'ADNc. Définir les paramètres de cyclage de PCR à 50 ° C pendant 2 min, puis 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min. Consultez le document de support du constructeur pour le fonctionnement de la machine qPCR. Calculer la courbe d'étalonnage en utilisant des données d'amplification à partir de la série de dilutions standard. Comparer les données d'amplification des échantillons d'ADNc à la courbe standard pour déterminer le nombre de copies. Consultez le document de support du constructeur pour le traitement des données. Utilisez l'outil de Web GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) pour calculer le fitness viral relative (d). REMARQUE: L'outil GRC accepte ADNc nombre de copies ou hauteurs chromatogramme de pointe à partir d'au moins deux points de temps que l'entrée, et délivre la différence de taux de croissance nette (d) entre les deux virus. Bien que l'outil peut calculer le taux de croissance nette de deux données de point de temps, il est fortement recommandé de données d'entrée à partir de trois points ou plus de temps. Utilisez uniquement des données obtenues à partir des points de temps dans la phase de croissance exponentielle (voir l'étape 5.4) pour obtenir des taux de croissance précis. Pour une description détaillée du modèle mathématique utilisé dans l'outil Web GRC, voir 20. Déterminer les rapports viraux utilisant chromatogram pointe-Heights Amplifier par PCR du VIH-1 Vif fragments contenant la séquence tag VifAB utilisant VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 positionne 5266-5291) et VifRev amorces (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 positions 5579 à 5553). Pour chaque réaction PCR, en utilisant 1 ul de l'ADNc, 1 x tampon de NH 4, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 2,5 U de Taq polymerase et 0,45 uM de chaque amorce. Ajouter de l'eau jusqu'à un volume final de 50 ul. Définir les paramètres de cyclage de PCR de trois cycles à 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, et 70 ° C pendant 1 min, suivie de 34 cycles à 94 ° C pendant 15 s, 58 ° C pendant 30 sec, et 70 ° C pendant 1 min, puis maintenez à 4 ° C. On purifie les produits de PCR en utilisant le kit de purification QIAquick PCR selon le protocole du fabricant. Soumettre les produits de PCR purifiés à un fournisseur de services séquençage de l'ADN pour le séquençage de Sanger. Vérifiez le niveau de qualité de lecture moyenne, qui doit être fournie par le service de séquençage. Si la précision moyenne d'appel de base est inférieure à 85%, refaire l'étape 6.10.1 à 6.10.3 Utilisez l'outil de web ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) pour calculer le ratio virale à chaque point de temps. L'outil nécessite le fichier de trace de séquence (* de .ab1) et la séquence 5 'du site de nucléotides d'intérêt. L'outil mesure l'intensité de pointe sur le site indiqué. Le rapport de l'intensité de pic correspond à la ration des deux virus (figure 4B). Utilisez l'outil GRC web ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) et les intensités maximales enregistrées comme entrée pour calculer remise en forme par rapport virale (d). Voir l'étape 6.10.6. 20