Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

OPMERKING: Het protocol, zoals hieronder beschreven, niet iedere patiënt identificeerbare informatie bevatten en wordt dus niet beschouwd Mensgebonden Onderzoek van de Universiteit van Washington Institutional Review Board of Human Onderwerpen Division. 1. Constructie van chimere HIV-1 NL4-3 Molecular Clones 1.1) Amplify Insert DNA Fragment Ontwerp chimerische primers. Helften van de 5 'van zowel voorwaartse en omgekeerde primers bevatten een HIV-1 vector sequentie, waarbij het fragment wordt ingevoegd. De 3 'helft van de primers het uiteinde van de insert-sequentie (Figuur 2) bevat. Zorg ervoor dat het chimère primersequentie behoudt de originele open reading frames. Gebruik primers ten minste 20 basen lang, met een smelttemperatuur hoger dan of gelijk aan 60 ° C, ~ 50% GC inhoud en een lage neiging tot primer dimeren, heterodimeren en / of hairpin structuren. Beoordelen deze eigenschappenmet behulp van de OligoAnalyzer webtool ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ). Met PCR 27 en het chimere primers insert DNA (Figuur 2) amplificeren. Voor elke PCR-reactie, gebruik 1X high fidelity buffer, 0,2 mM dNTPs, 1 U van high fidelity DNA polymerase, 0,5 uM van forward chimere primer, 0,5 uM van omgekeerde chimere primer en 1 pg0 ng DNA-monster uitvoeren insert regio. Voeg dH 2 O tot een eindvolume van 50 pi. Stel thermale cycli stappen als volgt: Voer een eerste DNA denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 10 sec. Amplificeer met 30 cycli van DNA denaturatie bij 98 ° C gedurende 10 seconden en DNA hybridisatie bij 3 ° C boven de laagste smelttemperatuur van beide primers voor 20 sec. Voer een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min. WINKEL PCR producten bij 4 ° C. Neem 5 pl van de PCR producten uit devorige stap en uitvoeren van agarosegelelektroforese 28. Gebruik een 0,7% agarosegel, 1 x TAE buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA), 0,5 ug / ml ethidiumbromide (EtBr) eindconcentratie en 1 kb ladder als DNA groottemerker. Set voedingsbron spanning tot 5 V / cm afstand tussen de elektroden. Stop de elektroforese als de ladingskleurstof migreert door ongeveer 2/3 van de lengte gel. Visualiseren onder toepassing van een gel documentatiesysteem 28. OPMERKING: EtBr is een verdacht carcinogeen en moet goed worden afgevoerd, per instelling regelgeving. Handschoenen moeten altijd gedragen worden bij het hanteren van gels die EtBr. Wissel naar nieuwe handschoenen na de finish handling EtBr bevattende materiaal en voor de behandeling van andere materialen of apparatuur om kruisbesmetting te voorkomen. Als er slechts één DNA-band met een grootte die overeenkomt met het gewenste PCR-product wordt gedetecteerd, zuiveren de rest van het PCR product met een commerciële kit zoals QIAquick PCR Purification Kit according de protocollen van de fabrikant. Als andere, niet-specifieke banden zijn aanwezig, met de rest van het PCR product aan preparatieve gelelektroforese werking. Gebruik dezelfde parameters en voorwaarden die in stap 1.1.4. Zorg ervoor dat de gel goed groot genoeg te laden ~ 45 pi PCR producten. Knip de band van belang en extraheer het DNA uit de gel onder gebruikmaking van QIAquick gel extractie kit volgens protocollen van de fabrikant. 1.2) Introduceer de Insert Fragment in Full-length Infectious HIV-1 Subtype B Vector (pNL4-3) Gebruik gezuiverde PCR producten uit stap 1.1.5 als PCR primers. Gebruik pNL4-3VifA 20 als matrijs-DNA in een PCR- reactie en gebruiken pNL4-3VifB 20 als matrijs in de overige reactie (Figuur 2). Voor elke PCR-reactie, gebruik 1x high fidelity buffer, 0,2 mM dNTPs, 2 U van high fidelity DNA polymerase, 500 ng primer DNA en 50 ng template DNA in een finale volume van 50 ui. Stel de thermische cycli parameters: 98 ° C gedurende 30 seconden, 35 cycli bij 98 ° C gedurende 10 sec, 48 ° C gedurende 1 min en 72 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 72 ° C gedurende 10 min. Voeg 10 U van Dpn I tot 50 ui van de PCR reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur aan het matrijs-DNA te verteren. Zorg ervoor dat het plasmide DNA wordt geïsoleerd uit een methylatie competent bacteriestam, bijv., TOP10 chemisch competente Escherichia coli. Gebruik Dpn I verteerd product aan de bevoegde bacteriële cellen te transformeren. Gebruik heat-shock transformatie met TOP10 chemisch competente E. coli, volgens het protocol van de fabrikant. Kiezen voor bacteriële cellen die het recombinante plasmide gebruikt Luria Broth (LB) kweek platen die 100 mg / l carbenicilline. Extra ~ 10 goed gescheiden koloniën en kweken afzonderlijk in 3 ml vloeibaar LB-medium dat 100 mg / L carbenicilline en incubeer bij 30 ° C in eenshaker O / N. Gebruik QIAprep Spin Miniprep kit plasmide-DNA te isoleren uit de bacteriële vloeibare kweek, volgens het protocol van de fabrikant. Met dubbele restrictiedigestie 29 om te bepalen of het plasmide-DNA bevat het juiste insert. Waardoor een van de restrictieplaatsen Alleen bij het insertgebied en andere restrictieplaats bestaat slechts eenmaal in de HIV-1 vector, buiten het insertgebied. Digest tenminste 300 ng plasmide-DNA in 10 pl uiteindelijk reactievolume. Select beperking buffers, incubatietemperatuur en incubatietijd volgens het protocol van de geselecteerde restrictie-enzymen van de fabrikant. Neem 9 ui van het geknipte DNA en run gelelektroforese zoals beschreven in stap 1.1.4. Selecteer recombinant plasmiden die DNA-banden van de voorspelde maten. Bevestig sequentie integriteit van de recombinante plasmiden door Sanger sequentiebepaling. Terwijl zeldzaam, ongewenstemutatie (s) kunnen in de PCR-reacties worden ingevoerd. Sequentie beide strengen van het plasmide DNA. Volg de instructies in stap 1.1.1.1 tot sequencing primers te ontwerpen. Bovendien zorgen dat de voorwaartse en omgekeerde sequentie-primers hybridiseren ten minste 50 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van het insertgebied in het recombinante plasmide, respectievelijk. Geef plasmide-DNA en sequencing primers commerciële DNA sequencing service provider. Bereid DNA-monster en primers zoals aangegeven door de dienstverlener. Een endotoxinevrij stock van het gemuteerde plasmide-DNA onder toepassing van een endotoxine-vrij plasmide-DNA kit volgens het protocol van de fabrikant. Bereid ten minste 1 pg endotoxine vrij plasmide DNA voor transfectie in de volgende stap. 1.3) Introduceer Kleinschalig Mutaties Via Site-directed mutagenese Ontwerp mutagene primers met overlappende voorwaartse en achterwaartse primers die de gewenste mutation (s). Plaats de base (s) worden vervangen, ingevoegd of verwijderd in het midden van de primers, geflankeerd door homologe 10-15 basen. Volg de instructies in stap 1.1.1.1. Met PCR mutante plasmiden synthetiseren. Voor elke PCR-reactie, gebruik 1x high fidelity buffer, 10 mM dNTPs, 2 U van high fidelity DNA polymerase, 0,5 uM van voorwaartse mutagene primer, 0,5 uM van omgekeerde mutagene primer en 50 ng van chimerische pNL4-3VifB, uit stap 1.2.6 , in een eindvolume van 50 pi. Stel de thermische cycli parameters: 98 ° C gedurende 30 seconden, 25 cycli bij 98 ° C gedurende 10 sec, 48 ° C gedurende 1 min en 72 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 72 ° C gedurende 10 min. Herhaal stap 1.2.2 naar 1.2.6. 2. Generation van virale Stock behulp Transfection Bereken de hoeveelheid virale stock gewenste en plasmide-DNA vereist. Met een virale titer van 10 4 IU / ml of hoger, 1,8 ml van virale voorraad is voldoende voor twee reeksen groeicompetitie assays, waaronder monoinfections, elk in drievoud uitgevoerd. Voor transfectie uitgevoerd in een 6-wells plaat wordt ongeveer 1,8 ml supernatant geoogst per putje. Eén ug plasmide-DNA is nodig voor elke transfectie uitgevoerd in een 6-wells plaat. Voor elk putje van een 6-wells plaat, bereiden 100 gl transfectie mengsel, bijv. Bestaande uit 1 pi X-tremeGENE 9 transfectie reagens (of vergelijkbaar product), 1 ug plasmide DNA en serumvrij DMEM. Bepaal de hoeveelheid plasmide-DNA nodig middels 1 ug plasmide-DNA per putje. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het plasmide-DNA ten minste 50 ng / ul. Bepalen hoeveel serumvrij medium (DMEM) nodig per well met de formule: totale volume van DMEM in pi = 100 gl – DNA volume ui. Voeg 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) cellen / putje in 2 ml propagatiemedium (DMEM + 10% foetaal runderserum (FBS)) in een 6-wells plaat. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een5% CO2 atmosfeer. Seed zoveel als nodig putjes (bepaald in stap 2.1). Om de transfectie mengsel bereiden aliquot het geschikte volume van serumvrij DMEM, zoals hierboven berekend, in een 1,8 ml polypropyleen microcentrifugebuis en voeg de transfectie reagens. Pipet reagens direct in de media oplossing, niet toe te voegen aan het plastic oppervlak van de microcentrifugebuis. Voeg plasmide DNA laatste. Pipet op en neer voorzichtig om de oplossing te mengen. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (15 ° C tot 25 ° C) om de vorming van complexen transfectie mogelijk. Voeg het mengsel in een druppelsgewijze wijze cellen uitgezaaid in 6-wells plaat. Schud of wervelen de putten om een ​​gelijkmatige verdeling van de transfectie complexen te verzekeren. Seal platen met plastic wrap. Incubeer kweken bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 48 uur. Gebruik een pipet voorzichtig verzamelen en overbrengen supernatant naar een 15 ml buis through een 0,22 pm filter top. Gebruik pipet om 250 ul of meer overdracht van de gefilterde bovendrijvende tot 1,8 ml microcentrifuge buizen met rubberen afdichtingen in de deksels. WINKEL gefilterde supernatanten bij -80 ° C tot gebruik. 3. Bepaal Infectieuze titer van virale voorraden op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) Stimuleer PBMCs met fytohemagglutinine (PHA). Per een virusvoorraad, zaad 2 x 10 6 PBMC's in volledig Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (cIMDM, IMDM aangevuld met 20 U / ml humaan interleukine 2 (hIL-2), 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine), aangevuld met PHA (1,5 ug / ml). Seed PBMCs bij 2 x 10 6 cellen / ml. Incubeer PBMC bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 72 uur. Harvest PHA gestimuleerde PBMC. Overdracht niet hechtende PHA-PBMC's een 50 ml conische buis. Spin buis bij 228 xg gedurende 10 min. Verwijder supernatant voorzichtig zonder disrupting de celpellet. Resuspendeer de celpellet tot een eindconcentratie van 2 x 10 5 PBMC / ml in cIMDM. Seed 2 x 10 4 PHA gestimuleerde PBMC / putje in 100 ul / well cIMDM in een ronde bodem 96-well plaat. Maak een 1:10 verdunning van het virale voorraad. Vervolgens, van de eerste verdunde stock, maak twaalf 3-voudige seriële verdunningen in een 96-well hoofdplaat. Deze verdunning regeling wordt aanbevolen voor het detecteren van virale titers in de range van 10 april – 10 juni infectieuze eenheid (IU) per ml. Bijvoorbeeld, voeg 20 ul van virusvoorraad met 180 ul medium in 1,5 ml buis. Meng de verwatering door voorzichtig pipetteren. Vervolgens over te dragen 90 pl van de verdunde bouillon in 180 ul media van de eerste goed en meng goed door pipetteren. Doorgaan verdunningsserie door de overdracht van 90 ul van de huidige goed op 180 ul media in de volgende goed elf keer. Verhoog of de aanvankelijke verwatering afnemen als titers hoger dan 10 6 IU / mlof lager dan 10 4 IU / ml verwacht, respectievelijk. Voeg 40 ul van de serieel verdund virale voorraad van de master verdunning plaat om de zaadjes PBMCs plaat (uit stap 3.3) in viervoud. Incubeer de platen bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 16-24 uur. Verwijder voorzichtig 100 pi supernatant uit elk putje en vervangen door 160 ul vers cIMDM tot een totaal volume van 200 ul / putje. Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO 2 atmosfeer (dag 1). Op dagen 4, 7, 10 en 13 overdragen 100 pl supernatant uit elk putje naar 100 pl verstoring buffer (2% Triton X-100 in PBS), en vervangen door 100 pl vers cIMDM. Bewaar de supernatanten bij -20 ° C. Houd het bemonsteren en het toevoegen van verse cIMDM elke drie dagen tot de titer stabiliseert. Bepaal de 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) van de virale voorraad door p24 ELISA met behulp van de dag 7 en 13 monsters zoals beschreven in stap 4. Als de TCID50 verkregen van dag 13 is duidelijk hoger dan de titer vanaf dag 7, kan de virus stock langer groeien nodig. Herhaal de p24 ELISA met latere monsters tot de besmettelijke titers van twee steekproeven tijdstippen worden stabiel (of daling). Select voorraden uit monsters met de hoogste titers. 4. ELISA (Enzyme-linked Immunoabsorbant Assay) Detectie van HIV-1 p24 voor het bepalen Virale infectieuze titer OPMERKING: Het volgende protocol werd ontwikkeld met behulp van p24 antigen capture platen bereid in ons laboratorium 30. Commercieel HIV-1 p24 ELISA plaat / kits kunnen ook worden gebruikt, volgens het protocol van de fabrikant. Voorafgaand aan het werken met samples, bereiden werkvoorraden van primair antilichaam (konijn anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum). Dooi p24 antiserum bij RT. Meng 2,5 ml glycerol met 2 ml van 10% FBS in Phosphate buffer saline (PBS). Voeg 0,5 ml van antiserum en meng. WINKEL 1 ml porties bij -20 ° C. Ontdooi monsters van stap 3.7 in een 37 ° C incubator. Was de p24 capture plaat 5 keer met wasbuffer (1x PBS met 0,05% Tween-20). Voeg 50 ul / putje van monster verdunningsmiddel (1% bovine serum albumine (BSA), 0,2% Tween-20 in RPMI-1640), voeg 50 pl monster aan geschikte putjes. Ten minste drie putjes met monsterverdunningsmiddel uitsluitend pseudo / negatieve controles. Incubeer 2 uur bij 37 ° C of O / N bij 4 ° C. Bereid de primaire antilichaamoplossing vers vóór gebruik. Maak een 1: 2000 verdunning van het primaire antilichaam werkvoorraden met het primaire antilichaam verdunningsmiddel (12% FBS in RPMI-1640). Zorg genoeg voorbereiding voor het gebruik van 100 gl oplossing per elk monster / controle putje in een 96-wells plaat. Bijvoorbeeld, om voldoende oplossing te maken voor één 96-well plaat, voeg 5 ul van het primaire antilichaam working voorraden het primaire antilichaam verdunningsmiddel voor een eindvolume van 10 ml. Was capture plaat 5 keer met wasbuffer. Voeg 100 ul van het primaire antilichaam oplossing in elk putje. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Bereid het secundaire antilichaam oplossing vers vóór gebruik. Maak een 1: 14.400 voudige verdunning van het secondaire antilichaam (1 mg / ml geit anti-konijn HRP) met het secondaire antilichaam verdunningsmiddel (7% FBS, 0,01% Tween-20 in RPMI-1640). Om pipetteerfouten beperken, voert een tweestaps seriële verdunning. Zorg genoeg voorbereiding voor het gebruik van 100 gl oplossing per elk monster / controle putje in een 96-wells plaat. Bijvoorbeeld, om voldoende oplossing te maken voor één 96-putjesplaat, eerst 1 pl van het secundaire antilichaam aan 99 pl van het secundaire antilichaam verdunningsmiddel. Voeg vervolgens 70 ul van de eerste verdunning tot het secundaire antilichaam verdunningsmiddel voor een eindvolume van 10 ml. Wash capture plaat 5 times met wasbuffer. Voeg 100 ul van het secundaire antilichaam-oplossing aan elk putje. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Was de plaat 5 keer met wasbuffer. Voeg 100 ul van RT TMB substraat. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in een gesloten container te beschermen tegen licht. Voeg 100 ul van RT stopoplossing (1 NH 2 SO 4). Lees absorptie bij 450-650 nm in elk putje met behulp van een microplaat reader. Gebruik de absorptie waarde aan elke evenals geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde scoren. Overweeg een goed op infectieus virus bevatten, indien de absorptiewaarde ten minste driemaal hoger dan de waarde gelezen uit pseudo / negatieve controle wells. Bereken TCID50 van het virale voorraad met behulp van het Reed-Meunch methode 31. 5. Bepaal Viral groeikinetiek 5.1) Monoinfection Seed 3 x 10 5-PHA gestimuleerde PBMC / putje in 48-well plaats in een totaal volume van 500 ul / putje. Deze cultuur platen bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer tot inoculatie. Voor elk virus, bereiden een entstof met 6.000 IE in 2 ml cIMDM. Inoculeer wells in drievoud door toevoeging van 500 gl van het inoculum (1500 IU) aan de geënte cellen. Het eindvolume van de geïnfecteerde celkweek 1 ml / putje en de MOI is 0,005. Aliquot 200 ul van de resterende inoculum overgebracht in twee 96-well platen voor RNA-isolatie, waarvan er één wordt opgeslagen als back-up. Incubeer kweken bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 16-24 uur. Wash kweken 16-24 uur na inoculatie. Verwijder en gooi 750 ul kweeksupernatant. Voeg 750 ul van verse cIMDM. Wikkel platen in plasticfolie en draai gedurende 10 minuten bij 300 x g. Verwijder en gooi 750 ul supernatant. Voeg 750 ul van verse cIMDM. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2 bijmosphere (dag 1). Monster culturen dagelijks van dag 2 tot dag 7. Breng 500 pi kweeksupernatant een 1,8 ml centrifugebuis. Centrifugeren gedurende 1 minuut bij 3000 x g. Overdracht 200 ul van het celvrije supernatant aan de twee 96-well platen sample voor RNA-isolatie, opnieuw op te slaan een bord als backup. WINKEL supernatanten bij -80 ° C totdat RNA-isolatie. Voeg 500 ul vers cIMDM aan elke cultuur. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Gooi culturen tot Wescodyne aan het einde van het experiment. Isoleer RNA uit 200 ul supernatant (gebruik de handel verkrijgbare kits zoals QIAamp Viral RNA Mini Kit) volgens standaard protocol van de fabrikant. Voor een groot aantal monsters, gebruik maken van de Qiagen QIAxtractor. WINKEL RNA monsters bij -80 ° C tot cDNA synthese. 5.2) cDNA Synthesis (reverse transcriptie) Voor elk RNA sruim, voeg 1,2 nmol dNTP en 1,2 pmol van cDNA synthese primer (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nucleotide 7968-7995) aan 10 ul van viraal RNA. Voeg water toe tot een uiteindelijk volume van 14 pl. Flick buis te mengen en spinnen kort vloeistof verzamelen op de bodem van de buis. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 65 ° C en vervolgens houden op 4 ° C totdat de master mix bereid. Bereid Master Mix behulp 5x eerste streng buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 5 mM DTT, 120 U van SuperScriptIII en 240 U RNase inhibitor. Voeg water toe tot de uiteindelijke volume van 10 pi. Voeg 10 ul van de master mix aan RNA mengsel, flick te mengen en spin te verzamelen. Incubeer het mengsel gedurende 90 min bij 50 ° C om de synthese van cDNA mogelijk te maken. Incubeer gedurende 15 minuten bij 70 ° C om reverse transcriptase inactiveren. Houden op 4 ° C indien nodig. Voeg 2 U van Rnase H, flick te mengen, en dan draaien om te verzamelen. Incubeer 20 minbij 37 ° C. WINKEL cDNA bij -20 ° C. 5.3) cDNA Kwantificering met behulp van qPCR System Bereid een standaard verdunning serie. Doe 10-voudige seriële verdunning van 3 x 10 6 kopieën / ul tot 30 kopieën / ul, van pNL4-3VifA. Gebruik gedestilleerd water voor verdunningen. Bereid de standaard verdunningsseries vers vóór gebruik of bereiden kleine series en laten -20 ° C. Niet in de vriezer-dooi de normen meer dan drie keer. Het opzetten van een 96-well qPCR reactie plaat. Zorg ervoor dat elke plaat ten minste één putje van negatieve controles, een drievoud van de standaard verdunningsseries en ten minste een kopie van elk cDNA monster. Voor elke qPCR reactie, gebruik 12,5 ul qPCR master mix, 0,2 uM sonde, 0,8 uM van elk van de voorwaartse en achterwaartse primers en 1 pi van cDNA of de standaard verdunning serie of water / buffer (voor de negatieve controle ook). Voeg water toe tot een uiteindelijk volume van 25 pl. De qPCR sonde is licht sensitive. Hou het in een gesloten container. CDNA verkregen uit pNL4-3VifA gebaseerde moleculaire kloon te detecteren, het Vifa primer-probe: VifAB voorwaartse primer (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VIFA reverse primer (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') en VifAB probe (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 '-MGBNFQ). Voor cDNA afgeleid van pNL4-3VifB gebaseerde kloon, met de VifB primer-probe: VifAB voorwaartse primer, probe en VifAB VifB reverse primer (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '). Stel PCR cyclusparameters tot 50 ° C gedurende 2 min, 95 ° C gedurende 10 minuten en 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min. Raadpleeg steun van de fabrikant document voor bediening van de machine qPCR. Bereken een standaardcurve met behulp van gegevens uit de triplo standaard verdunningsserie. Vergelijken amplificatie gegevens van de cDNA monster op de standaardcurve voor het aantal kopieën te bepalen. Raadpleeg steun van de fabrikant document voor data processing. 5.4) Bepaal Viral exponentiële groei Fase Plot virale groei kinetiek de dag sampling langs de X-as en de cDNA-kopieaantal langs de Y-as en identificeren van het virale exponentiële groeifase, bijv. Wanneer de virale cDNA-kopie aantallen vermeerdering van een exponentiële progressie. Gebruik de GRC webtool ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) om virale groei (g) te berekenen. In deze aanvrage, het GRC gereedschap accepteert cDNA kopie getallen van ten minste twee tijdstippen als invoer en voert het virale groei (g). Gebruik alleen tijdstip gegevens binnen de exponentiële groeifase (zie stap 5.4.1 hierboven) om nauwkeurige groeicijfers te verkrijgen. Voor een gedetailleerde beschrijving van het wiskundige model worden gebruikt in de GRC webtool, zie 20. 6. Groei Competitie Assay Seed 3 x 10 5 </ Sup>-PHA gestimuleerde PBMC (of 1 x 10 5 CEMx174 cellen) in 500 ul totaal volume per putje in een 48 goed platbodem plaat. Blijf plaat 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer tot inoculatie. Voor elk virus, voor te bereiden 3 ml entstof bevatten 6.000 IE. Breng 1,5 ml van elk viraal inoculum in een steriele buis de dubbele infectie inoculum maken. Voeg 500 ul van tweevoudige inoculum (1500 IU) tot 3 x 10 5 cellen in een 48-wells plaat. Het uiteindelijke cultuur volume 1 ml / putje. Aliquot 200 ul van het inoculum twee 96-well platen voor RNA-isolatie; behalve een plaat als een back-up. Incubeer geënte cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 atmosfeer gedurende 16-24 uur. Wash kweken 16-24 uur na inoculatie. Verwijder en gooi 750 ul kweeksupernatant. Voeg 750 ul van verse cIMDM. Wikkel platen in plasticfolie en draai gedurende 10 min bij 300 x g. Verwijder en gooi 75081; l supernatant. Voeg 750 ul van verse cIMDM. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2 atmosfeer (dag 1). Selecteer bemonsteringstijdstippen ten minste 3 tijdstippen in de exponentiële groeifase waargenomen in stap 5.4.1 omvatten. Voor elke bemonstering, volgt u stap 5.1.7. Voer cDNA synthese zoals beschreven in paragraaf 5.2. Bepaal de virale variant verhouding met behulp van qPCR. Bereid een standaard seriële verdunningsreeks in drievoud, 10-voudig verdund in elke stap van 3 x 10 6 kopieën / ul tot 30 kopieën / pl pNL4-3VifA. Het opzetten van een 96-well qPCR reactie plaat. Zorg ervoor dat elke plaat ten minste één negatieve controle, de standaard verdunningsreeks in drievoud en duplicaten van elk cDNA monster. Voor elke qPCR reactie, gebruik 12,5 ul qPCR Master Mix, 0,2 uM sonde, 0,8 uM van elk van de voorwaartse en achterwaartse primers en 1 pi van cDNA of de standaard d ilution serie of water / buffer (voor de negatieve controle putten). Voeg water toe tot een uiteindelijk volume van 25 pl. De qPCR sonde is lichtgevoelig, houd het in een gesloten container. Gebruik Vifa primer-probe om signalen te detecteren in de negatieve controles en de standaard verdunningsseries en een duplicaat van het cDNA monster. Gebruik VifB primer-probe met andere duplicaat van het cDNA monster. Stel PCR cyclusparameters tot 50 ° C gedurende 2 min, vervolgens 95 ° C gedurende 10 min en vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min. Raadpleeg steun van de fabrikant document voor bediening van de machine qPCR. Bereken de standaardkromme middels amplificatie gegevens van het standaard verdunningsserie. Vergelijken amplificatie gegevens van de cDNA monsters met de standaardkromme om kopieaantal te bepalen. Raadpleeg steun van de fabrikant document voor gegevensverwerking. Gebruik de GRC webtool (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) relatieve virale fitness (d) te berekenen. OPMERKING: Het GRC hulpmiddel accepteert cDNA kopiëren nummers of chromatogram piekhoogte uit ten minste twee tijdstippen als de input, en voert de netto-groei verschil (d) tussen de twee virussen. Terwijl het gereedschap van de netto-groei van twee tijdstip gegevens kunnen berekenen, is het sterk aanbevolen om input gegevens van drie of meer tijdstippen. Gebruik alleen de gegevens verkregen uit tijdstippen binnen de exponentiële groei fase (zie stap 5.4) om nauwkeurige groeicijfers te verkrijgen. Voor een gedetailleerde beschrijving van het wiskundige model worden gebruikt in de GRC webtool, zie 20. Bepaal virale verhoudingen met chromatogram peak-hoogten PCR versterken HIV-1 vif fragmenten die de VifAB volgorde tag met VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 positioneert 5266-5291) en VifRev primers (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 posities 5579-5553). Voor elke PCR reactie werd gebruikt 1 pl cDNA, 1 x NH 4 buffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq polymerase en 0,45 pM van elke primer. Voeg water toe tot een uiteindelijk volume van 50 pl. Stel PCR cyclusparameters tot 3 cycli bij 94 ° C gedurende 1 min, 55 ° C gedurende 1 min en 70 ° C gedurende 1 min, gevolgd door 34 cycli bij 94 ° C gedurende 15 sec, 58 ° C gedurende 30 sec, en 70 ° C gedurende 1 min, en vervolgens houden op 4 ° C. Zuiver PCR producten met behulp van de QIAquick PCR zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant. Geef gezuiverde PCR producten die een DNA sequentie dienstverlener voor Sanger sequentiebepaling. Controleer de gemiddelde read kwaliteit score, die moet worden verstrekt door de sequencing service. Als de gemiddelde nauwkeurigheid basis oproep minder dan 85%, opnieuw stap 6.10.1 naar 6.10.3 Gebruik de ChromatQuan webtool (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) virale verhouding te berekenen op elk tijdstip. De machine moet de sequentie traceringbestand (* .ab1) en de sequentie 5 'aan de nucleotide plaats van belang. De tool meet de piek intensiteit op de opgegeven locatie. De verhouding van de piekintensiteit overeenkomt met de verhouding van de twee virussen (Figuur 4B). Gebruik de GRC webtool ( http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ) en de opgenomen piekintensiteiten als input voor virale relatieve fitness (d) te berekenen. Zie stap 6.10.6. 20