İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Bu araştırma araştırma içeren insanların etik davranış konusunda Helsinki Dünya Tıp Birliği'nin Deklarasyonu çerçevesinde yapıldı ve Facultad de Medicina, UNAM (proje numarası 101-2012) Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. İnsan Mezenkimal Kök Hücre 1. izolasyonu Reaktifin hazırlanması % 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) ve ek hazırlayın. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı, yüksek glikoz (HG-DMEM) hazırlayın ve bir 0.2 mikron filtre içinden süzme ile,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik solution.Sterilize Bu kültür ortamı ilave edin. FBS ya da antibiyotik-antimikotik çözelti olmadan HG-DMEM 100 U / ml bir kolajenaz II çözeltisi hazırlayın. , Izolasyon için gerekli otoklav ile aşağıdaki cerrahi aletler, sterilize: Standart makass, basit kesme forseps, ince noktası ve dişli forseps ve neşter sapı (# 4). İnsan amniyon zarının mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu Tek elle göbek bağını tutun ve diğer elinizle, yaklaşık 5 cm 2 bir parçasını elde etmek için, bir saydam tabaka gibi görünüyor amniyotik membran (AM), ayırmak. Koryon kısmı numune içerisinde mevcut olması halinde koryon bölümü amniyon daha kalın olduğu için, el ile diseksiyon ile temel koryon ayırın. PBS 5 ml üç yıkar ile artık kan çıkarın ve basit forseps ile pıhtıları çıkarın. Yaklaşık 0.5 cm 2 parçalarını üretmek için neşter ile AM küçük bir kesim olun. Amniyon zarının enzimatik sindirimi % 0.125 tripsin, 5 ml /% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 50 ml konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca 37 ° C 'de 0.5 mM EDTA çözeltisi ile AM inkübe edin. 250 santrifüjxg ve 5 dakika için 25 ° C sıcaklığa getirilmiş ve süpernatan atarak tripsin uzaklaştırın. Ara sıra Leyva ve ark göre çalkalanarak bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 2 saat boyunca kollajenaz tip 15 ml II solüsyonu eklenir ve inkübe edilir. 9 Hemen kolajenaz II ile sindirmeden sonra 250 x g hızında 15 ml PBS ve santrifüj ilave edin ve 10 dakika boyunca 25 ° C. Süpernatant atılır ve 250 x g hızında PBS çözeltisi ve santrifüj 15 ml ve 15 dakika için 25 ° C hücre pelet yıkayın. Süpernatantı atın. Hafifçe sallayarak HG-DMEM 10 ml hücresel pelletini. Mezenkimal kök hücrelerin genişlemesi Tohum 2 kültür şişesi içinde hücre süspansiyonu (1 x 10 4 hücre / cm2) ml ve bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C'de hücreler HG-DMEM 2 ml ilave edilir ve inkübe edilir. 5-7 sonra kültür ortamı değiştirerek yapışmayan hücre ortadangün. Bu süre sonunda,% 90 oranında hücresel izdiham elde etmek için ek 7-10 gün için kültür ortamı her 3 günde bir değiştirin. Hücreleri yeniden elde etmek ve% 0.125 tripsin / EDTA solüsyonu (tripsinizasyon) bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe. Hemen tripsinizasyondan sonra 5 dakika boyunca 250 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj bir pipet ve transferi hücreleri toplamak. Süpernatantı atın ve HG-DMEM 10 ml hücresel pelletini. Kültür hücre iki kez 75 cm2 kültür şişelerinde süspansiyonu (her bir şişeye 5 ml) ve% 90 birbirine karışana kadar kültürünü. Tekrarlayın 1.4.3 adımları. 1.4.6 için, 9. geçit veya alt kültür kadar. Flow sitometri veya diğer çalışmalar için 1.4.5 adımlar 1.4.3 gibi tripsinizasyon hücreleri kurtarın. Gözenekli Kemik Matriks Disk 2. Hazırlık (NKB) NKB diskleri ıslak(Çap 12 mm, kalınlığı 2 mm)., Her disk inkübe gece boyunca ile Fassina ark.'nın patentine uygun olarak 3 ila 37 ° C 'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde FBS'siz HG-DMEM mi, 5 Islatma işleminden sonra, fazla kültür ortamı ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca 250 x g'de 50 ml konik bir tüp ve bir dönüş diski yerleştirin. 24 gözlü bir hücre kültürü plakasının diski yerleştirin. HG-DMEM 500 ul ilave edin ve 25 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edin. Hiçbir kabarcıklar besin ve hücrelerin doğru dağılımını lehine NKB diskte mevcut olduğundan emin olun. Kabarcıklar diskte gözlenirse, sarsıntı ve kültür ortamında 300 ul ekle ve 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, 15 dakika boyunca inkübe edin. Bu sürenin sonunda, hücre kültürü duvarından emme kültür ortamında 300 ul kaldırmak ve hava kabarcığı meydana olduğunu teyit etmektedir. Basit bir forseps kullanılarak yeni bir 24 oyuklu plaka diski yerleştirin. <p class= "Jove_title"> 3. Gözenekli Sığır Matrix İnsan Mezenkimal Kök Hücre Kültürü Önceden ıslatılmış biyo materyal diskin yüzeyi üzerinde, üç alt kültürlerden (HG-DMEM 100 ul içinde 5 x 10 5:00-hMSCs) hücresel bir süspansiyon Seed ve 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, 30 dakika boyunca inkübe ° C. Hücreler tüm iskele topografya ile etkileşim sağlamak için biyomalzeme üst yüzünde yavaş yavaş ve sürekli bu adımı gerçekleştirin. Not: Bu prosedür, Tablo 1 'de gösterilen biyo ekli hücrelerin% 60 elde edilir. 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde 3 gün için kültür, 37 ° C'de HG-DMEM 1.5 ml ilave edilir, ve korumak. Kaçının kültür ortamının ilave türbülans oluşturmayan bu kültür plakası çanak alt hücre birikme. Bu ilk kez. Akış sitometride tarafından 4. Hücre Yüzey İşaretleyiciler karakterizasyonutrisi Matris diskte onları ekim önce 9. altkültür hücreleri ayırın. % 0.25 tripsin / 1 mM EDTA kullanarak ve buz gibi soğuk% 2 formaldehit 30 dakika boyunca sabitleyin. Tespit sonra,% 0.05 bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. Buz üzerinde 3 dakika boyunca% 20, insan bağışıklık, hücreler inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma bloke ve fikoeritrin (PerCP) 0.1 x 10 6 hücre alikotları inkübe CD73 FITC-konjüge Mab CD90, CD34 karşı PE-konjuge MAb karşı MAb ile konjüge edilmiş Karanlıkta 25 ° C 'de 1 saat süre ile, sonra ya FITC-konjüge Mab CD45 PE-konjuge Mab CD105. İzotip uyumlu FITC-konjüge Mab, PE-konjuge Mab andPerCP-konjuge Mab negatif kontroller olarak hizmet edecektir. Bilgi kaydı ve analizi için yazılım kullanılarak yüzey markerlerinin ekspresyon seviyelerini hesaplar. Taramalı Elektron Mikroskobu 5. Hücre Adezyon Algılama PBS ile iki kez kültür 3 gün hücre disk örnekleri durulayınve 0.1 M Na-kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) solutionin% 4 (hacim / hacim), glutaraldehid ile fixthe örnekleri. Daha önce Rivera-N ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi., Mikroskopik gözlem için 10 numune hazırlayın ve 15 kV arasında bir elektrik potansiyelinde ve 500X ve 2000X büyütülmüş bir tarama elektron mikroskobu kullanılarak dikkate alınmalıdır. 6. Hücre Proliferasyon Deneyi Kültür ortamı, 1.5 ml ihtiva eden hücre disk örnekleri için, 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde hücreleri, üreticinin talimatlarına hayati renklendirici (AB) göre 150 ul ekle ve inkübe edilir. Hemen AB (0 saat) ilavesi ve hücre kültürü 7 gün ulaşana kadar, her 24 saat sonra, 600 nm'lik bir referans dalga boyu ile 570 nm'de absorbansı ölçülür. 7. Koloni Oluşturma Birimi (CFU) 11 Kültür, 100, 100 mm doku kültürü Diskin HG-DMEM başına hücre ve 14 için inkübe37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde gün. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca metanol içerisinde% 0.5 kristal mor ile PBS ile kültür ve leke yıkayın. PBS ile iki kez yıkayın plakaları ve hemasitometre kullanarak görünür koloniler sayılır.