Выделение мезенхимальных стволовых клеток человека и их культивировании на пористых Bone Matrix

Это исследование было проведено в соответствии с декларации Всемирной медицинской ассоциации Хельсинки в отношении этического поведения исследований с участием людей и был одобрен научно-исследовательского этического совета факультета при де Медицина, НАУ (код проекта 101-2012). 1. Выделение мезенхимальных стволовых клеток Подготовка реагента Подготовка фосфатным буфером физиологический раствор (PBS) и добавку с 1% -ным раствором антибиотика-противогрибкового. Подготовка модифицированной среде Дульбекко Игла, с высоким содержанием глюкозы (DMEM-HG), и добавить 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков противогрибковое solution.Sterilize этот культуральной среды путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм. Приготовьте раствор коллагеназы II в 100 ЕД / мл в HG-DMEM без FBS или антибиотик противогрибкового раствора. Стерилизовать следующие хирургические инструменты, которые необходимы для выделения, в автоклаве: стандартный ножницамис, простой Режущая щипцы, тонкая точка и зубчатые щипцы и скальпель ручки (# 4). Выделение мезенхимальных стволовых клеток человека амниотической мембраны Держите пуповину одной стороны, и с другой стороны, отсоедините амниотической мембраны (АМ), который выглядит как полупрозрачный лист, чтобы получить фрагмент примерно 5 см 2. Если секция хориона присутствует в образце, отделить лежащую хориона при ручном вскрытия в разделе хориона толще, чем амнион. Удалить остатки крови с тремя промывками 5 мл PBS и удалить сгустки с простыми щипцов. Сделайте небольшой надрез в AM скальпелем, чтобы генерировать фрагменты примерно 0,5 см 2. Переваривание ферментом амниотической мембраны Инкубируйте AM 5 мл 0,125% трипсина / 0,5 мМ раствора EDTA при 37 ° С в течение 30 мин в 50 мл коническую пробирку при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Центрифуга на 250XG и 25 ° С в течение 5 мин, а затем удалить раствора трипсина путем отбрасывания супернатанта. Добавить 15 мл раствора коллагеназы типа II и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы при периодическом встряхивании в соответствии с Лейва др. 9 Сразу после расщепления коллагеназы II, добавить 15 мл PBS и центрифуге при 250 мкг и 25 ° С в течение 10 мин. Жидкость над осадком сливают и промывают клеточный осадок с 15 мл раствора PBS и центрифуге при 250 мкг и 25 ° С в течение 15 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл DMEM-HG, встряхивая осторожно. Расширение мезенхимальных стволовых клеток Семян 2 мл клеточной суспензии (1 х 10 4 клеток / см 2) в культуральной колбы и добавляют 2 мл среды DMEM-HG, и инкубируют клетки при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы. Устранить неадгезированных ячейку путем изменения культуральной среды после 5-7дней. По истечении этого времени, изменение культуральной среды каждые 3 дня в течение еще 7-10 дней, чтобы получить клеточный слияния 90%. Восстановление клеток и инкубируют их в течение 5 мин при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы с 0,125% раствора трипсина / EDTA (трипсином). Сразу же после обработки трипсином, собирают клетки с помощью пипетки и переносят в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют клеточный осадок в 10 мл DMEM-HG. Подвеска Культура клеток в двух 75 см 2 колбах культуры (5 мл в каждую колбу), и поддерживать культуру до 90% слияния. Повторите шаги 1.4.3. в пункте 1.4.6, до 9 прохода или субкультуры. Восстановление клеток от трипсинизации, как в шагах 1.4.3 1.4.5 для проточной цитометрии или других исследований. 2. Подготовка пористой Bone матричный диск (НКБ) Мочить диски Нкб(Диаметр, 12 мм; толщина 2 мм)., Инкубировать каждый диск в течение ночи с 3 мл DMEM-HG без FBS в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С, в соответствии с Fassina др 5 После процесса смачивания, поместите диск в 50 мл коническую трубку и спина при 250 мкг в течение 5 мин для удаления избытка культуральной среде. Поместите диск в клеточной культуральной пластины 24 а. Добавить 500 мкл DMEM-HG, и инкубируют в течение 30 мин при 25 ° С. Убедитесь, что нет пузырей присутствуют на диске NKB в пользу правильного распределения питательных веществ и клеток. Если пузырьки наблюдаются на диске, встряхнуть и добавить 300 мкл культуральной среды и инкубируют в течение 15 мин в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. По истечении этого времени удалить 300 мкл культуральной среды сосать через стенку культуры клеток и также подтверждают, что не образуются пузыри. Поместите диск в новом 24-луночного планшета с помощью простых щипцами. <p class= "Jove_title"> 3. Культура мезенхимальных стволовых клеток человека на пористых крупного рогатого скота Matrix Заполнение клеточной суспензии (5 х 10 5 утра-hMSCs в 100 мкл DMEM-HG) с трех субкультур, на поверхности предварительно смачивают биоматериала диска и инкубируют в течение 30 мин в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. Выполните этот шаг медленно и непрерывно на верхней поверхности биоматериала, чтобы клетки, чтобы взаимодействовать с рельефом всех строительных лесов. Примечание: Эта процедура достигает 60% клеток, прикрепленных на биоматериала, представленные в таблице 1. Добавить 1,5 мл DMEM-HG при 37 ° С, и поддерживать культуру в течение 3 дней в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. Не генерировать турбулентность в добавлении к культуральной среде избежать осаждения клеток на дно культуры пластины тарелки. Это начальный момент времени. 4. клеточной поверхности маркеры Характеристика потоком Cytomметрия Открепления клеток из 9-й субкультуры перед посевом их на матричном диске. Использование 0,25% трипсина / 1 мМ ЭДТА и исправить их в течение 30 мин в ледяной 2% формальдегида. После фиксации, мыть клетки один раз с 0,05% PBS. Блок неспецифическое связывание путем инкубации клеток с 20% человеческого иммуноглобулина в течение 3 мин на льду и инкубировать 0,1 х 10 6 клеток аликвоты фикоэритрином (PerCP) -conjugated моноклональное антитело против CD73, FITC-конъюгированного МАТ CD90, PE-сопряженных моноклональных антител против CD34 , ФИТЦ-конъюгированное MAb CD45 и РЕ-конъюгированные МАТ CD105 в течение 1 ч при 25 ° С в темноте. Изотипа FITC-сопряженных МКА, PE-сопряженных МКА andPerCP-сопряженных МАБ будут служить в качестве отрицательного контроля. Рассчитать уровни экспрессии поверхностных маркеров с помощью программного обеспечения для сбора и анализа данных. 5. Сотовый обнаружения адгезии методом сканирующей электронной микроскопии Промыть образцы клеток диском на 3 суток культивирования дважды PBSи fixthe образцы с 4% (объем / объем) глутарового альдегида solutionin в 0,1 М Na-какодилата буфера (рН 7,2). Подготовка образцов для микроскопического наблюдения, как сообщалось ранее в Rivera-N и др. 10 и наблюдать с помощью сканирующего электронного микроскопа при электрическом потенциале 15 кВ и при увеличении 500X и 2000X. 6. клеточной пролиферации Пробирной Для образцов клеток-диск, содержащий 1,5 мл культуральной среды, добавляют 150 мкл жизненно красителя (AB) в соответствии с рекомендациями производителя и инкубировать клетки в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. Сразу же после добавления AB (0 ч) и каждого 24 ч до достижения 7 дней культивирования клеток, измеряют поглощение при 570 нм с контрольной длиной волны 600 нм. 7. колониеобразующие единицы (КОЕ) 11 Культура 100 клеток на 100 мм культуре ткани Дискин HG-DMEM и инкубировать в течение 14дней в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С. Промыть культуры с PBS и пятна с 0,5% кристаллическим фиолетовым в метаноле в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Вымойте тарелки с PBS в два раза и подсчет видимые колонии с помощью гемоцитометра.