Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen en hun kweek op de poreuze botmatrix

Dit onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van de World Medical Association's van Helsinki betreffende de ethische gedrag van onderzoek met mensen en werd goedgekeurd door de Research Ethic Raad van Facultad de Medicina, UNAM (projectnummer 101-2012). 1. Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen Bereiding van het reagens Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en vullen met 1% antibiotica-antimycotische oplossing. Bereid Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, hoog glucose (HG-DMEM) en voeg 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycoticum solution.Sterilize dit kweekmedium door filtratie door een 0,2 urn filter. Bereid een collagenase II oplossing bij 100 U / ml in HG-DMEM zonder FBS en antibioticum-antimycotische oplossing. Steriliseer de volgende chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de isolatie, autoclaaf: standaard schaars, eenvoudige ontleden tang, puntig en getande tang en een scalpel handgreep (# 4). Isolatie van mesenchymale stamcellen van humane amniotische membraan Houd de navelstreng met één hand en met de andere hand, maak de amnionmembraan (AM), die lijkt op een doorschijnende foelie, om een fragment van ongeveer 5 cm2 verkrijgen. Als het gedeelte chorion in het monster aanwezig is, scheiden de onderliggende chorion handmatig dissectie het gedeelte chorion is dikker dan het amnion. Resten bloed met drie wassingen van 5 ml PBS en stolsels schaffen eenvoudige tang. Maak een kleine snede in de AM met de scalpel om fragmenten van ongeveer 0,5 cm 2 te genereren. Enzymatische afbraak van amnionmembraan Incubeer de AM met 5 ml 0,125% trypsine / 0,5 mM EDTA oplossing bij 37 ° C gedurende 30 min in een 50 ml conische buis bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Centrifugeer 250xg en 25 ° C gedurende 5 minuten en verwijder de trypsine-oplossing door afdanking van het supernatant. Voeg 15 ml collagenase type II oplossing en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer met af schudden volgens Leyva et al. 9 Direct na digestie met collagenase II, voeg 15 ml PBS en centrifugeer bij 250 xg en 25 ° C gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en was de cellulaire pellet met 15 ml PBS oplossing en centrifugeer bij 250 xg en 25 ° C gedurende 15 min. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellulaire pellet in 10 ml van HG-DMEM Door licht schudden. Uitbreiding van mesenchymale stamcellen Zaad 2 ml celsuspensie (1 x 10 4 cellen / cm2) in cultuur kolf en voeg 2 ml van HG-DMEM en incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Elimineer de niet-hechtende cellen door het veranderen van het kweekmedium na 5-7dagen. Hierna verandert het kweekmedium elke 3 dagen nog eens 7-10 dagen met een mobiel samenvloeiing van 90% verkregen. Herstel de cellen en incubeer ze gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer met 0,125% trypsine / EDTA-oplossing (trypsine). Onmiddellijk na behandeling met trypsine, verzamel cellen met een pipet overgebracht in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellulaire pellet in 10 ml van HG-DMEM. Cultuur celsuspensie in twee 75 cm2 kolven (5 ml per kolf) en de kweek tot 90% confluentie handhaven. Herhaal de stappen 1.4.3. naar 1.4.6, tot 9 passage of subcultuur. Herstel cellen door behandeling met trypsine in stap 1.4.3 tot 1.4.5 voor flowcytometrie of andere studies. 2. Voorbereiding van de poreuze botmatrix Disk (NKB) Te nat de NKB schijven(Diameter 12 mm, dikte 2 mm). Incuberen elke schijf overnacht met 3 ml van HG-DMEM zonder FBS in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C, volgens Fassina et al 5 Na de bevochtiging proces, plaatst u de schijf in een 50 ml conische buis en draaien op 250 xg gedurende 5 minuten om het overtollige kweekmedium te verwijderen. Plaats de schijf in een 24 goed celkweekplaat. Voeg 500 ul van HG-DMEM en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ° C. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn op de NKB schijf naar de juiste verdeling van voedingsstoffen en cellen voorstander zijn. Wanneer luchtbellen worden waargenomen op de schijf, schud en voeg 300 pl cultuurmedium en incubeer gedurende 15 min in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Na deze tijd verwijderen 300 ul kweekmedium zuigen door de wand van zowel celculturen en bevestigen dat er geen luchtbellen vormen. Plaats de schijf in een nieuwe 24-well plaat met eenvoudige tang. <p class= "Jove_title"> 3. Cultuur van menselijke mesenchymale stamcellen op de poreuze rundermatrix Seed een celsuspensie (5 x 10 05:00-hMSCs in 100 pl van HG-DMEM) drie subculturen, op het oppervlak van de vooraf bevochtigde biomateriaal schijf en incubeer gedurende 30 min in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Voer deze stap langzaam en continu op het bovenvlak van het biomateriaal om de cellen te interageren met de topografie van scaffold. Opmerking: Dit proces komt 60% van de cellen bevestigd aan de in de tabel 1 biomateriaal. Voeg 1,5 ml van HG-DMEM bij 37 ° C en houdt de kweek gedurende 3 dagen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Gebruik turbulentie genereren in de toevoeging van kweekmedium voor voorkomen dat de afzetting van cellen op de bodem van kweekplaat schotel. Dit is de eerste keer. 4. celoppervlaktemerkers Karakterisering door Flow CytomEtry Maak de cellen van 9 e subcultuur voor het zaaien ze op de matrix schijf. Gebruik 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en bevestig ze gedurende 30 min in ijskoude 2% formaldehyde. Na fixatie, was de cellen eenmaal met 0,05% PBS. Blokkeer niet-specifieke binding door incuberen van de cellen met 20% humaan immunoglobuline gedurende 3 minuten op ijs geïncubeerd en 0,1 x 10 6 cellen monsters met phycoerythrine (PerCP) geconjugeerd Mab tegen CD73 FITC-geconjugeerde MAb CD90, PE-geconjugeerde MAb tegen CD34 FITC-geconjugeerd CD45 MAb en PE-geconjugeerde MAb CD105 gedurende 1 uur bij 25 ° C in het donker. Overeenkomend isotype FITC-geconjugeerde MAb, PE-geconjugeerde MAb andPerCP-geconjugeerde MAb zal dienen als negatieve controles. Bereken de expressieniveaus van het oppervlak markers met software voor data acquisitie en analyse. 5. Cel Adhesie Detectie door Scanning Electron Microscopy Spoel de cel-schijf monsters op 3 dagen van de cultuur tweemaal met PBSen fixthe monsters met 4% (v / v) glutaaraldehyde solutionin een 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (pH 7,2). Bereid de monsters voor microscopische waarneming, zoals eerder gerapporteerd door Rivera-N et al. 10 en observeren met een scanning elektronenmicroscoop op een elektrische potentiaal van 15 kV en bij een vergroting van 500X en 2000X. 6. celproliferatietest De cel-disk monsters met 1,5 ml kweekmedium, voeg 150 pl vitale kleurstof (AB) volgens de richtlijnen van de fabrikant en incubeer de cellen in een vochtige atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Onmiddellijk na toevoeging van AB (0 uur) en elke 24 uur tot aan 7 dagen celkweek, meet de absorptie bij 570 nm met een referentie golflengte van 600 nm. 7. Colony Forming Unit (CFU) 11 Cultuur 100 cellen per 100 mm weefselkweek Diskin HG-DMEM en incubeer gedurende 14dagen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Was de cultuur met PBS en vlek met 0,5% kristalviolet in methanol gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Was de plaatjes met PBS twee keer en tel de zichtbare kolonies met behulp van een hemocytometer.