Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Diese Untersuchung wurde in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki des Weltärztebundes betreffend das ethische Verhalten der Forschung am Menschen durchgeführt und von der Forschung Ethik Board of Facultad de Medicina, UNAM (Projektnummer 101-2012) genehmigt. 1. Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen Herstellung von Reagenz Bereiten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Zuschlag mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung. Bereiten Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, hoher Glucose (HG-DMEM), und gibt 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum-Antimykotikum solution.Sterilize dieses Kulturmedium durch Filtration durch einen 0,2 um Filter. Bereiten Sie eine Collagenase II Lösung bei 100 U / ml in HG-DMEM ohne FBS und Antibiotika-Antimykotika-Lösung. Sterilisieren Sie die folgenden chirurgischen Instrumenten, die für die Isolierung benötigt werden, durch Autoklavieren: Standard-Scheres, einfache Dissektionszangen, feinPunkt und Zahnzange und eine Skalpellgriff (# 4). Isolierung von mesenchymalen Stammzellen humanen Amnionmembran Halten Sie die Nabelschnur mit einer Hand und mit der anderen Hand, nehmen Sie den Amnionmembran (AM), die wie eine durchlässige Scheibe aussieht, um ein Fragment von etwa 5 cm 2 zu erhalten. Wenn das Chorion Abschnitt in der Probe vorhanden ist, trennen Sie die zugrunde liegenden Chorion durch manuelle Dissektion als das Chorion Abschnitt ist dicker als die Fruchtblase. Rückstände von Blut mit drei Wäschen von 5 ml PBS und Blutgerinnsel entfernen, mit den einfachen Zange. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Uhr mit dem Skalpell, um Fragmente von etwa 0,5 cm 2 zu erzeugen. Enzymatische Verdauung von Amnionmembran Inkubieren AM mit 5 ml 0,125% Trypsin / 0,5 mM EDTA-Lösung bei 37 ° C für 30 min in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Zentrifuge bei 250xg und 25 ° C für 5 Minuten und entfernen Sie die Trypsin-Lösung von der Überstand verworfen. 15 ml Kollagenase Typ II-Lösung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Atmosphäre unter gelegentlichem Schütteln nach Leyva et al. 9 Unmittelbar nach der Verdauung mit Collagenase II, 15 ml PBS und Zentrifugation bei 250 × g und 25 ° C für 10 min. Überstand verwerfen und waschen Sie den Zellpellet mit 15 ml PBS-Lösung und Zentrifuge bei 250 xg und 25 ° C für 15 min. Überstand verwerfen. Resuspendieren Zellpellet in 10 ml HG-DMEM durch leichtes Schütteln. Expansion von mesenchymalen Stammzellen Seed 2 ml der Zellsuspension (1 x 10 4 Zellen / cm 2) in Kulturflasche, und 2 ml von HG-DMEM und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Die Beseitigung der nicht-adhärenten Zellen durch Änderung des Kulturmediums nach 5-7Tagen. Nach dieser Zeit, ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage für weitere 7-10 Tage, um eine zelluläre Zusammenfluss von 90% zu erhalten. Recover die Zellen und Inkubation sie für 5 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre mit 0,125% Trypsin / EDTA-Lösung (Trypsinierung). Unmittelbar nach Trypsinisierung gesammelt Zellen mit einer Pipette und in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugiert bei 250 g für 5 min. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 10 ml HG-DMEM. Kulturzellsuspension in zwei 75 cm 2 Kulturflaschen (5 ml in jeden Kolben) und die Kultur bis zu 90% Zusammenfluss aufrechtzuerhalten. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3. bis 1.4.6, bis zum 9. Durchgang oder Subkultur. Recover Zellen durch Trypsinisierung wie in den Schritten 1.4.3 bis für die Durchflusszytometrie oder andere Studien 1.4.5. 2. Herstellung der porösen Knochenmatrix Datenträger (NKB) Um die NKB Scheiben nass(Durchmesser 12 mm; Dicke 2 mm). Inkubieren jede Platte über Nacht mit 3 ml HG-DMEM ohne FBS in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C, nach Fassina et al 5 Nach der Benetzungsprozess, setzen Sie die Festplatte in einem 50 ml konischen Rohr und Spin bei 250 xg für 5 min, um überschüssige Kulturmedium zu entfernen. Legen Sie die Festplatte in einer 24-Well-Zellkulturplatte. Gib 500 ul der HG-DMEM und Inkubation für 30 min bei 25 ° C. Darauf achten, dass keine Luftblasen auf der NKB Platte, um die richtige Verteilung der Nährstoffe und Zellen begünstigen vorhanden sind. Wenn sich Blasen an der Platte festgestellt, schütteln und 300 ul Kulturmedium und Inkubation für 15 min in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Nach dieser Zeit entfernen 300 ul Kulturmedium, das Saugen durch die Wand des Zellkultur und bestätigen, dass sich keine Blasen bilden. Legen Sie die Festplatte in einem neuen 24-Well-Platte mit einfachen Zange. <p class= "Jove_title"> 3. Kultur von humanen mesenchymalen Stammzellen auf der porösen Matrix Bovine Saatgut eine Zellsuspension (5 x 10 & sup5 AM-hMSCs in 100 ul DMEM-HG) von drei Subkulturen, die auf der Oberfläche des vorbenetzten Biomaterial Platte und Inkubation für 30 min in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Diesen Schritt langsam und kontinuierlich auf der oberen Fläche des Biomaterials, damit die Zellen mit der Topographie des gesamten Gerüsts zusammenwirken. Hinweis: Dieses Verfahren wird erreicht, 60% der Zellen auf der in der Tabelle 1 gezeigt Biomaterial gebunden. 1,5 ml von HG-DMEM bei 37 ° C und halten die Kultur für 3 Tage in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Turbulenzen in der Zugabe von Kulturmedium für vermeiden erzeugen Sie nicht, dass die Ablagerung von Zellen auf dem Boden des Kulturplatte Gericht. Dies ist Anfangszeit. 4. Zelloberflächenmarker Charakterisierung von Flow Cytometrie Trennen Sie die Zellen aus 9. Subkultur vor der Aussaat sie auf der Matrix Platte. Verwenden Sie 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und befestigen Sie sie für 30 Minuten in eiskaltem 2% Formaldehyd. Nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS 0,05%. Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation der Zellen mit 20% Human-Immunglobulin für 3 Minuten auf Eis inkubiert und 0,1 x 10 6 Zellen Aliquots mit Phycoerythrin (PerCP) -konjugiertem MAb gegen CD73, FITC-konjugierten monoklonalen CD90, PE-konjugierte MAb gegen CD34 FITC-konjugiertem MAb CD45 und PE-konjugiertem MAb CD105 für 1 h bei 25 ° C im Dunkeln. Isotyp-FITC-konjugiertem MAb, PE-konjugiertem MAb andPerCP konjugierten MAb wird als negative Kontrollen dienen. Berechnung der Expressionsniveaus der Oberflächenmarkern unter Verwendung von Software für die Datenerfassung und -analyse. 5. Cell Adhesion Erkennung durch Rasterelektronenmikroskopie Zweimal mit PBS spülen zellScheibenProben bei 3 Tagen Kulturund fixthe Proben mit 4% (v / v) Glutaraldehyd solutionin einer 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,2). Vorbereitung der Proben für die mikroskopische Beobachtung, wie zuvor von Rivera-N et al. 10 und Beobachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop bei einer elektrischen Spannung von 15 kV und bei einer Vergrößerung von 500X und 2000X. 6. Cell Proliferation Assay Zu den Zellplatten-Proben mit 1,5 ml Kulturmedium mit 150 & mgr; l von Vitalfarbstoff (AB) nach Herstellervorgaben und Inkubieren der Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Sofort nach der Zugabe von AB (0 h) und jeweils 24 h bis zum Erreichen von 7 Tagen nach der Zellkultur wird die Extinktion bei 570 nm mit einer Referenzwellenlänge von 600 nm. 7. koloniebildende Einheit (CFU) 11 Kultur 100 Zellen pro 100 mm-Gewebekultur Diskin HG-DMEM und Inkubation für 14Tage in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Waschen der Kultur mit PBS und Fleck mit 0,5% Kristallviolett in Methanol für 5-10 min bei Raumtemperatur. Zweimal Waschen Sie die Platten mit PBS und zählen Sie die sichtbaren Kolonien mit einer Zählkammer.