ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

本研究は、人間が関与する研究の倫理的な行動に関するヘルシンキの世界医師会の宣言に従って行われたとFacultadデ食事と、UNAM（プロジェクト番号101から2012）の研究倫理委員会によって承認された。 ヒト間葉系幹細胞の単離試薬の調製リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製し、1％抗生物質 – 抗真菌溶液を補充する。 ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（HG-DMEM）を調製し、0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質 – 抗真菌solution.Sterilizeこの培地を加える。 FBSまたは抗生物質 – 抗真菌ソリューションなしでHG-DMEMで100 U / mlのコラゲナーゼII溶液を調製する。 標準はさみ：オートクレーブ滅菌による単離のために必要とされる以下の手術器具を、滅菌sの、単純な切開鉗子、細かい点と歯鉗子およびメスハンドル（＃4）。 人間の羊膜の間葉系幹細胞の単離片手でへその緒を持ち、もう一方の手で、約5cm 2の断片を得るために、半透明のシートのように見える羊膜（AM）を、デタッチ。絨毛膜部が試料中に存在する場合には絨毛膜部が羊膜よりも厚いように、手動の切開によって、基礎となる絨毛膜を​​分離する。 5mlのPBSの3回の洗浄で残留血液を取り出し、簡単な鉗子で血栓を取り除く。約0.5cm 2の断片を生成するために、メスで午前中に小さなカットを行います。 羊膜の酵素消化 0.125％トリプシンを5ml / 5％CO 2雰囲気中で37℃で50mlの円錐管中で30分間37℃で0.5mMのEDTA溶液でAMをインキュベートする。 250での遠心機XGと25°Cで5分間、その後、上清を捨てることによってトリプシン溶液を除去。 コラゲナーゼII型溶液15mlを加え、時折レイバらによると、振とうしながら、5％CO 2雰囲気中で37℃で2時間インキュベートする。9 直ちにコラゲナーゼIIで消化した後、10分間、250×gで25℃で15 mlのPBSと遠心を追加する。 上清を捨て、250×gでPBS溶液と遠心分離機の15ミリリットルと15分間、25℃で細胞のペレットを洗浄。上清を捨てる。 軽く振りHG-DMEM 10ml中の細胞のペレットを再懸濁。 間葉系幹細胞の増殖培養フラスコ中の種子の細胞懸濁液2mlを（1×10 4細胞/ cm 2）、およびHG-DMEM 2 mlを追加し、5％CO 2雰囲気中37℃で細胞をインキュベートする。 5-7の後に培地を変更することにより、非接着細胞を除去する日。 この時間の後、90％の細胞集密度を得るために、追加の7~10日間3日ごとに培地を変える。 細胞を回収し、0.125％トリプシン/ EDTA溶液（トリプシン処理）で5％CO 2雰囲気中で37℃で5分間、それらをインキュベートする。 すぐにトリプシン処理した後、5分間250×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にピペットと転送で細胞を集める。 上清を捨て、HG-DMEM 10mlの細胞のペレットを再懸濁。 2 75cm 2の培養フラスコ（各フラスコ中の5ml）中の培養細胞懸濁液を、90％コンフルエンスになるまで培養を維持する。 繰り返します1.4.3を繰り返します。 1.4.6に、第9の通路またはサブカルチャーまで、。 フローサイトメトリーや他の研究のために1.4.5に1.4.3のステップのように、トリプシン処理により細胞を回収する。 多孔質骨基質ディスク（NKB）の調製 NKBディスクを濡らし（直径12mmで、厚さ2mm）を、Fassina らによると、37℃、5％CO 2の加湿雰囲気中FBSなしHG-DMEM 3mlの一晩各ディスクをインキュベートする5。 湿潤処理後、過剰の培地を除去し、5分間250×gで50mlの円錐管とスピンディスクを置く。 24ウェル細胞培養プレートにディスクを置きます。 HG-DMEM500μlのを追加し、25℃で30分間インキュベートする。気泡が栄養素と細胞の正確な分布を優先するようにNKBのディスク上に存在していないことを確認してください。 気泡がディスク上に認められた場合には、振ると培地300μlを添加し、37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で15分間インキュベートする。この時間の後だけでなく、細胞培養の壁を通って吸引培養液300μlのを削除し、気泡が形成されないことを確認してください。 シンプルな鉗子を使用して、新しい24ウェルプレートにディスクを置きます。 <p class= "jove_title"> 3。多孔牛マトリックス上のヒト間葉系幹細胞の培養予め湿らせた生体材料ディスクの表面上の3つのサブカルチャーからの細胞懸濁液（5×10 5 AM-hMSCのHG-DMEM100μl中）に播種し、37℃で5％のCO 2の加湿雰囲気中で30分間インキュベートする°C。細胞はすべての足場の地形と対話できるように生体材料の上面にゆっくりと継続的にこの手順を実行します。注：この手順は、 表1に示した生体材料に付着した細胞の60％を達成する。 37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で3日間培養して、37℃でHG-DMEMの1.5ミリリットルを追加し、維持する。その培養プレート皿の底上の細胞の堆積回避のための培養培地の添加で乱流を生成しません。これは最初の時間です。 フローCytom 4.細胞表面マーカーのキャラクタリゼーションetry 行列のディスク上に播種する前に9 番目のサブカルチャーから細胞を切り離します。 0.25％トリプシン/ 1mM EDTAを使用し、氷冷2％ホルムアルデヒド中で30分間それらを修正。固定後、0.05％PBSで細胞を1回洗浄します。 氷上で3分間20％のヒト免疫グロブリンで細胞をインキュベートすることによって非特異的結合をブロックし、フィコエリトリン（PerCP標識）で0.1×10 6細胞のアリコートをインキュベートは、CD73、FITC結合mAb CD90、CD34に対するPE結合mAbに対するmAb -結合暗闇の中で25℃で1時間、FITC結合mAb CD45およびPE結合mAb CD105。アイソタイプが一致したFITC結合mAb、PE結合mAb andPerCP結合mAbを陰性対照にサービスを提供する。 データ収集と分析のためのソフトウエアを用いて表面マーカーの発現レベルを計算する。 走査型電子顕微鏡5.細胞接着の検出 PBSで2回3日間の培養における細胞のディスクのサンプルをリンス0.1 MのNa-カコジル酸緩衝液（pH7.2）solutionin 4％（v / v）のグルタルアルデヒドfixtheサンプル。 10。以前らリベラ-Nによって報告されるように、顕微鏡観察のための試料を調製し、15kVでの電位にし、500X及び2000Xの倍率で走査型電子顕微鏡を用いて観察する。 6.細胞増殖アッセイ培地1.5 mlを含有する細胞のディスクのサンプルを、製造業者のガイドラインに従ってバイタル色素（AB）の150μlを添加し、37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で細胞をインキュベートする。 すぐに、細胞培養の7日に達するまでAB（0時間）、各24時間の添加後、600nmの参照波長で570nmで吸光度を測定する。 7コロニー形成単位（CFU）11 培養100mmの組織培養diskin HG-DMEM当たり100細胞および14インキュベート37℃、5％CO 2の加湿雰囲気中日。 室温で5〜10分間、メタノール中0.5％クリスタルバイオレットで染色し、PBSで培養物を洗浄する。 二回PBSでプレートを洗浄し、血球計数器を使用して目に見えるコロニーを数える。