Isolement de mésenchymateuses humaines cellules souches et de leur culture sur la matrice osseuse poreuse

Cette recherche a été effectuée conformément à la Déclaration d'Helsinki de l'Association médicale mondiale en ce qui concerne l'éthique de la recherche avec des êtres humains et a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche de la Facultad de Medicina, UNAM (numéro de projet 101-2012). 1. Isolement de cellules souches mésenchymateuses humaines Préparation du réactif Préparer la solution de tampon phosphate salin (PBS) et supplément avec une solution antibiotique-antimycotique de 1%. Préparer Eagle modifié de Dulbecco Medium, haute teneur en glucose (DMEM-HG), et à 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d'antibiotique-antimycotique solution.Sterilize ce milieu de culture par filtration à travers un filtre de 0,2 um. Préparer une solution collagénase II à 100 U / ml dans HG-DMEM sans FBS ou une solution antibiotique-antimycosique. Stériliser les instruments chirurgicaux suivants, qui sont nécessaires pour l'isolement, par autoclavage: ciseaux normes, une pince de dissection simples, à pointe fine et une pince à griffes et une poignée de scalpel (n ° 4). Isolement de cellules souches mésenchymateuses de la membrane amniotique humaine Maintenez le cordon ombilical avec une main et avec l'autre main, décoller la membrane amniotique (AM), qui ressemble à une feuille translucide, pour obtenir un fragment d'environ 5 cm 2. Si la section de chorion est présent dans l'échantillon, séparer le chorion sous-jacent par dissection manuelle que la section de chorion est plus épaisse que l'amnios. Retirer les résidus de sang avec trois lavages de 5 ml de PBS et de retirer les caillots avec la pince simples. Faire une petite incision dans l'AM avec le scalpel pour générer des fragments d'environ 0,5 cm 2. Digestion enzymatique de membrane amniotique Incuber l'heure avec 5 ml de 0,125% de trypsine / solution 0,5 mM d'EDTA à 37 ° C pendant 30 min dans un tube conique de 50 ml à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Centrifugeuse à 250xg et 25 ° C pendant 5 min, puis on élimine la solution de trypsine par élimination du surnageant. Ajouter 15 ml de solution de collagénase de type II et incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% en agitant de temps en fonction de Leyva et al. 9 Immédiatement après digestion avec de la collagénase II, ajouter 15 ml de PBS et centrifuger à 250 x g et à 25 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire avec 15 ml de solution PBS et centrifuger à 250 x g et 25 ° C pendant 15 min. Jeter le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 10 ml de HG-DMEM en agitant doucement. L'expansion de cellules souches mésenchymateuses Graine 2 ml de suspension de cellules (1 x 10 4 cellules / cm 2) dans la fiole de culture et ajouter 2 ml de DMEM et HG-incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Éliminer la cellule non adhérente en changeant le milieu de culture après 5-7jour. Après ce temps, changer le milieu de culture tous les 3 jours pendant encore 7 à 10 jours pour obtenir une confluence cellulaire de 90%. Récupérer les cellules et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% de solution de trypsine / EDTA 0,125% (de trypsinisation). Immédiatement après traitement à la trypsine, recueillir des cellules avec une pipette et transférer dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 250 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 ml de HG-DMEM. Culture suspension cellulaire dans deux flacons de 75 cm2 de culture (5 ml dans chaque flacon), et maintenir la culture jusqu'à 90% de confluence. Répétez les étapes 1.4.3. à 1.4.6, jusqu'à la 9ème passage ou sous-culture. Récupérer les cellules par trypsinisation comme dans les étapes 1.4.3 à 1.4.5 pour cytométrie de flux ou d'autres études. 2. Préparation de la matrice osseuse poreuse Disk (NKB) Pour mouiller les disques NKB(Diamètre, 12 mm; épaisseur 2 mm)., Incuber chaque disque pendant une nuit avec 3 ml de DMEM sans HG-FBS dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C, selon la Fassina et al 5 Après le processus de mouillage, placez le disque dans un tube conique de 50 ml et de spin à 250 g pendant 5 min pour éliminer l'excès de milieu de culture. Placez le disque dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Ajouter 500 ul de DMEM-HG et incuber pendant 30 min à 25 ° C. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes sur le disque NKB à favoriser la distribution correcte de nutriments et de cellules. Si des bulles sont observées sur le disque, agiter et ajouter 300 ul de milieu de culture et incuber pendant 15 min dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C. Après ce temps, retirer 300 pi de milieu de culture sucer à travers la paroi de la culture cellulaire bien et confirment qu'aucun des bulles se forment. Placez le disque dans une nouvelle plaque de 24 puits en utilisant une pince simples. <p class= "Jove_title"> 3. Culture de mésenchymateuses humaines cellules souches sur la matrice poreuse bovine Amorçage de la suspension cellulaire (5 x 10 5 AM-CSMh dans 100 ul de DMEM-HG) à partir de trois sous-cultures, sur la surface du disque préhumidifié biomatériau et incuber pendant 30 min dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C. Effectuer cette étape lentement et en continu sur la face supérieure du biomatériau pour permettre aux cellules d'interagir avec la topographie de l'ensemble échafaudage. Remarque: Cette procédure permet d'obtenir le 60% ​​des cellules fixées sur le biomatériau indiqué au tableau 1. Ajouter 1,5 ml de HG-DMEM à 37 ° C, et maintenir la culture pendant 3 jours dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C. Ne pas générer des turbulences dans l'addition de milieu de culture pour éviter que le dépôt de cellules sur le fond du plat de la plaque de culture. Ce est le temps initial. 4. cellulaire marqueurs de surface Caractérisation par Flow Cytometry Détacher les cellules de 9 e sous-culture avant de les ensemencer sur le disque de matrice. Utilisez 0,25% de trypsine / EDTA 1 mM et les fixer pendant 30 min dans glacée 2% de formaldéhyde. Après la fixation, laver les cellules une fois avec 0,05% de PBS. Bloquer la liaison non spécifique par incubation des cellules avec 20% d'immunoglobuline humaine pendant 3 minutes sur de la glace et incuber 0,1 x 10 6 aliquotes de cellules à la phycoérythrine (PerCP) conjugué à MAb contre CD73, MAb conjugué à FITC CD90 PE-conjugués MAb contre CD34 , MAb conjugué à FITC et CD45 PE-conjugués MAb CD105 pendant 1 heure à 25 ° C dans l'obscurité. Isotype FITC conjugué anticorps monoclonal, PE-conjugué anticorps monoclonal andPerCP conjugué anticorps monoclonal servira de contrôles négatifs. Calculer les niveaux des marqueurs de surface en utilisant un logiciel pour l'acquisition et l'analyse des données d'expression. 5. Cellule de détection d'adhérence par microscopie électronique à balayage Rincer les cellules échantillons disque à 3 jours de culture deux fois avec du PBSet fixthe échantillons avec 4% (v / v) de glutaraldéhyde solutionin un tampon 0,1 M de cacodylate de Na (pH 7,2). Préparer les échantillons en vue de l'observation microscopique, comme indiqué précédemment par Rivera-N et al. 10 et d'observer au microscope électronique à balayage à un potentiel électrique de 15 kV et à un grossissement de 500X et 2000X. 6. prolifération cellulaire Assay Pour les échantillons de cellules disques contenant 1,5 ml de milieu de culture, ajouter 150 ul de colorant vital (AB) selon les directives du fabricant et incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C. Immédiatement après l'addition de AB (0 h) et chaque 24 h jusqu'à atteindre 7 jours de culture de cellules, mesurer l'absorbance à 570 nm avec une longueur d'onde de 600 nm de référence. 7. unité formant colonie (UFC) 11 Culture 100 cellules par 100 mm diskin de culture de tissus HG-DMEM et incuber pendant 14jours dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C. Laver la culture avec du PBS et tache avec 0,5% de violet cristallisé dans du methanol pendant 5 à 10 min à température ambiante. Laver les plaques avec du PBS deux fois et compter les colonies visibles en utilisant un hémocytomètre.