El aislamiento de células madre mesenquimales humanas y su cultivo en la matriz del hueso poroso

Esta investigación se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki con respecto a la conducta ética de los seres humanos de investigación que involucra y fue aprobado por la Junta Ética de Investigación de la Facultad de Medicina de la UNAM (proyecto número 101-2012). 1. Aislamiento de mesenquimales humanas de células madre Preparación del reactivo Preparar la solución tamponada con fosfato salino (PBS) y suplemento con solución de antibiótico-antimicótico al 1%. Preparar medio de Eagle modificado por Dulbecco, alta glucosa (HG-DMEM), y añadir 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% solution.Sterilize antibiótico-antimicótico este medio de cultivo por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Preparar una solución de colagenasa II en 100 U / ml en HG-DMEM sin FBS o solución antibiótico-antimicótico. Esterilizar los siguientes instrumentos quirúrgicos, que son necesarios para el aislamiento, por autoclave: tijera estándars, pinzas de disección simples, de punta fina y unas pinzas dentadas y un mango de bisturí (# 4). Aislamiento de células madre mesenquimales de membrana amniótica humana Mantenga el cordón umbilical con una mano y con la otra mano, separe la membrana amniótica (MA), que se parece a una lámina translúcida, para obtener un fragmento de aproximadamente 5 cm 2. Si la sección de corion está presente en la muestra, separar el corion subyacente por disección manual de como la sección de corion es más grueso que el amnios. Eliminar la sangre residual con tres lavados de 5 ml de PBS y eliminar los coágulos con los simples pinzas. Hacer un pequeño corte en la mañana con el bisturí para generar fragmentos de aproximadamente 0,5 cm 2. La digestión enzimática de la membrana amniótica Incubar la AM con 5 ml de 0,125% de tripsina / EDTA 0,5 mM solución a 37 ° C durante 30 min en un tubo cónico de 50 ml a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Centrifugar a 250xg y 25 ° C durante 5 min y luego eliminar la solución de tripsina descartando el sobrenadante. Añadir 15 ml de solución de colagenasa tipo II y se incuba durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 con agitación ocasional de acuerdo con Leyva et al. 9 Inmediatamente después de la digestión con colagenasa II, añadir 15 ml de PBS y centrifugar a 250 xg y 25 ° C durante 10 min. Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento celular con 15 ml de solución de PBS y centrifugar a 250 xg y 25 ° C durante 15 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de DMEM-HG agitando suavemente. Expansión de las células madre mesenquimales Semilla 2 ml de suspensión de células (1 x 10 4 células / cm 2) en frasco de cultivo, y añadir 2 ml de HG-DMEM y se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Eliminar el de células no adherentes cambiando el medio de cultivo después de 5-7día. Después de este tiempo, cambiar el medio de cultivo cada 3 días durante un período adicional de 7-10 días para obtener una confluencia celular del 90%. Recuperar las células y se incuban durante 5 minutos a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% con solución de tripsina / EDTA 0,125% (tripsina). Inmediatamente después de tripsinización, recoger las células con una pipeta y transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de HG-DMEM. Cultivo en suspensión de células en dos matraces de cultivo de 75 cm 2 (5 ml en cada matraz), y mantener el cultivo hasta 90% de confluencia. Repita los pasos 1.4.3. a 1.4.6, hasta el noveno paso o subcultura. Recuperar las células por tripsinización como en los pasos 1.4.3 al 1.4.5 para citometría de flujo u otros estudios. 2. Preparación de la matriz ósea disco poroso (NKB) Para humedecer los discos NKB(Diámetro, 12 mm; espesor, 2 mm)., Incubar cada disco durante la noche con 3 ml de HG-DMEM sin ​​FBS en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C, de acuerdo con Fassina et al 5 Después de que el proceso de humectación, coloque el disco en un tubo cónico de 50 ml y centrifugado a 250 xg durante 5 min para eliminar el exceso de medio de cultivo. Colocar el disco en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Añadir 500 l de HG-DMEM y se incuba durante 30 min a 25 ° C. Asegúrese de que no hay burbujas en el disco NKB para favorecer la correcta distribución de los nutrientes y células. Si se observan burbujas en el disco, agitar y añadir 300 l de medio de cultivo y se incuba durante 15 minutos en una atmósfera húmeda de CO2 al 5% a 37 ° C. Después de este tiempo eliminar 300 l de medio de cultivo succión a través de la pared del cultivo celular bien y confirmar que no se forman burbujas. Coloque el disco en una nueva placa de 24 pocillos utilizando pinzas simples. <p class= "Jove_title"> 3. Cultivo de células madre mesenquimales humanas en la Matriz de bovino poroso Seed una suspensión celular (5 x 10 05 a.m.-hMSC en 100 l de HG-DMEM) a partir de tres subcultivos, en la superficie del disco biomaterial previamente mojado y se incuba durante 30 min en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 a 37 ° C. Realice este paso lentamente y de forma continua sobre la cara superior del biomaterial para permitir que las células interactúan con la topografía de todo andamio. Nota: Este procedimiento logra el 60% de las células unidas sobre el biomaterial se muestra en la Tabla 1. Añadir 1,5 ml de HG-DMEM a 37 ° C, y mantener el cultivo durante 3 días en un ambiente humidificado del 5% de CO 2 a 37 ° C. No generar turbulencia en la adición de medio de cultivo para evitar que la deposición de las células en el fondo del plato placa de cultivo. Este es el tiempo inicial. 4. Cell Marcadores de superficie Caracterización por Flow Cytometría Separe las células del 9º subcultura antes de la siembra en el disco matriz. Utilice 0,25% de tripsina / EDTA 1 mM y fijarlos durante 30 min en helado 2% de formaldehído. Después de la fijación, se lavan las células una vez con PBS 0,05%. Bloquear la unión no específica mediante la incubación de las células con 20% de inmunoglobulina humana durante 3 min en hielo y se incuba 0,1 x 10 6 alícuotas de células con ficoeritrina (PerCP) conjugado con MAb contra CD73, FITC-conjugado MAb CD90, MAb conjugado con PE contra CD34 , FITC-conjugado MAb CD45 y PE conjugado MAb CD105 durante 1 hora a 25 ° C en la oscuridad. Corresponde con el isotipo conjugado con FITC MAb, PE-conjugado MAb andPerCP conjugado MAb servirá como controles negativos. Calcular los niveles de expresión de los marcadores de superficie utilizando el software de adquisición y análisis de datos. 5. Móvil de Detección de Adhesión por microscopía electrónica de barrido Enjuagar las muestras de células de disco a los 3 días de cultivo dos veces con PBSy fixthe muestras con 4% (v / v) de glutaraldehído solutionin un M de tampón Na-cacodilato 0,1 (pH 7,2). Preparar las muestras para la observación microscópica, como se informó anteriormente por Rivera-N et al. 10 y observar con un microscopio electrónico de barrido a un potencial eléctrico de 15 kV y con una ampliación de 500X y 2000X. Ensayo de proliferación de la célula 6. Para las muestras de células-disco que contiene 1,5 ml de medio de cultivo, añadir 150 l de colorante vital (AB) de acuerdo con las directrices del fabricante y se incuban las células en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Inmediatamente después de la adición de AB (0 h) y cada 24 h hasta alcanzar los 7 días de cultivo celular, medir la absorbancia a 570 nm con una longitud de onda de referencia de 600 nm. 7. unidad formadora de colonias (CFU) 11 Cultura 100 células por 100 mm diskin cultivo de tejidos HG-DMEM y se incuba durante 14días en un ambiente humidificado del 5% de CO 2 a 37 ° C. Lavar el cultivo con PBS y se mancha con 0,5% de cristal violeta en metanol durante 5-10 min a temperatura ambiente. Lavar las placas con PBS dos veces y contar las colonias visibles usando un hemocitómetro.