בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

מחקר זה בוצע בהתאם להכרזה של ההסתדרות הרפואית העולמית של הלסינקי לגבי ההתנהגות האתית של בני אדם מחקר מעורב ואושר על ידי מועצת המנהלים מחקר האתיקה של Facultad de Medicina, UNAM (פרויקט מספר 101-2,012). 1. בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם הכנה של מגיב הכן פתרון פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ותוספת 1% פתרון אנטיביוטיקה antimycotic. הכן בינוני של הנשר, גלוקוז גבוה (HG-DMEM) השתנה Dulbecco, ולהוסיף 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% solution.Sterilize אנטיביוטיקה antimycotic מדיום תרבות זו על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. הכן פתרון collagenase השני ב 100 U / ml בHG-DMEM ללא FBS או פתרון אנטיביוטיקה antimycotic. לעקר את מכשירי הניתוח הבאים, אשר יש צורך לבידוד, על ידי מעוקר: מספריים סטנדרטייםים, מלקחיים לנתח פשוטים, עדין נקודה ומלקחי שיניים וידית אזמל (מס '4). בידוד של תאי גזע mesenchymal של קרום מי שפיר אדם להחזיק את חבל הטבור ביד אחת ועם היד השנייה, לנתק את הקרום מי השפיר (בבוקר), שנראה כמו גיליון שקוף, כדי להשיג בר של כ 5 סנטימטר 2. אם הסעיף סיסית נמצא במדגם, להפריד סיסית בסיס על ידי נתיחה ידנית כסעיף סיסית הוא עבה יותר amnion. הסר דם שייר עם שלושה שוטף של 5 מיליליטר של PBS ולהסיר קרישים עם המלקחיים הפשוטים. לעשות חתך קטן בבוקר עם האזמל כדי ליצור שברים של כ 0.5 סנטימטר 2. עיכול אנזימתי של קרום מי שפיר דגירה בבוקר, עם 5 מיליליטר של טריפסין 0.125% / 0.5 פתרון mM EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 37 ° C באווירת 5% CO 2. צנטריפוגה ב 250XG ו -25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את פתרון טריפסין על ידי השלכת supernatant. הוסף 15 מיליליטר של collagenase סוג II פתרון דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2, כאשר מדי פעם רועדת לפי ייבה et al. 9 מייד לאחר עיכול עם collagenase השני, להוסיף 15 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG ו -25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בטל supernatant ולשטוף את הכדור הסלולרי עם 15 מיליליטר של תמיסת PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG ו -25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בטל supernatant. Resuspend גלולה הסלולרי ב 10 מיליליטר של HG-DMEM ידי ניעור בעדינות. התרחבות של תאי גזע mesenchymal זרע 2 מיליליטר של השעיה תא (1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר) בבקבוק התרבות, ולהוסיף 2 מיליליטר של HG-DMEM ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. לחסל את התאים הלא-חסיד-ידי שינוי התרבות הבינוני לאחר 5-7ימים. לאחר פרק זמן זה, לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים ל7-10 ימים נוספים כדי להשיג מפגש סלולארי של 90%. לשחזר את תאי דגירתם במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 עם 0.125% פתרון טריפסין / EDTA (trypsinization). מייד לאחר trypsinization, לאסוף תאים עם טפטפת והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend גלולה הסלולרי ב 10 מיליליטר של HG-DMEM. ההשעיה תרבית תאים בשתי 75 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות (5 מיליליטר בבקבוק אחד), ולשמור על התרבות עד מפגש 90%. חזור על השלבים 1.4.3. ל1.4.6, עד המעבר או תת-תרבות -9. לשחזר תאים על ידי trypsinization כמו בשלבים 1.4.3 ל1.4.5 לזרימת cytometry או מחקרים אחרים. 2. הכנת נקבובי עצם מטריקס הדיסק (NKB) להרטיב את דיסקי NKB (קוטר, 12 מ"מ, עובי, 2 מ"מ)., דגירה כל דיסק לילה עם 3 מיליליטר של HG-DMEM ללא FBS באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס, על פי et al Fassina 5 לאחר תהליך ההרטבה, הנח את הדיסק בצינור חרוטי 50 מיליליטר וספין ב 250 XG במשך 5 דקות כדי להסיר בינוני תרבות עודפת. הנח את הדיסק בצלחת תרבית תאי 24 גם. הוסף 500 μl של HG-DMEM ו דגירה של 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. ודא שאין בועות נמצאות בדיסק NKB להעדיף חלוקה הנכונה של חומרים מזינים ותאים. אם בועות הם נצפו בדיסק, לנער ולהוסיף 300 μl של מדיום התרבות ודגירה במשך 15 דקות באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן זה להסיר 300 μl של מדיום התרבות מוצצת דרך הקיר של תרבית תאים היטב ולוודא שאין בועות טופס. הנח את הדיסק בצלחת 24 גם חדשה באמצעות מלקחיים פשוטים. <p class= "Jove_title"> 3. תרבות של תאי גזע mesenchymal האדם בשור מטריקס הנקבובי זרעי השעיה סלולרית (5 x 10 5 AM-hMSCs בשל HG-DMEM 100 μl) משלוש תת-תרבויות, על פני השטח של הדיסק הביולוגי-רטוב מראש דגירה במשך 30 דקות באווירת humidified של 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. לבצע שלב זה באיטיות ובאופן רציף על פני העליון של החומר הביולוגי כדי לאפשר לתאים אינטראקציה עם הטופוגרפיה של כל הפיגום. הערה: הליך זה משיג 60% מהתאים המצורפים בחומר הביולוגי שמוצג בטבלת 1. להוסיף 1.5 מיליליטר של HG-DMEM על 37 מעלות צלזיוס, ולשמור על התרבות במשך 3 ימים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לא ליצור מערבולת בתוספת של מדיום תרבות ללהימנע מזה בתצהיר של תאים בתחתית צלחת צלחת התרבות. זו פעם ראשונה. אפיון סמני משטח 4. תא על ידי זרימת Cytometry לנתק את התאים מתת-תרבות -9 לפני זריעתם על מטריצת הדיסק. השתמש 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ולתקן אותם למשך 30 דקות בפורמלדהיד 2% קרים כקרח. בעקבות קיבעון, לשטוף את התאים פעם אחת עם 0.05% PBS. לחסום הלא ספציפי מחייב על ידי דוגרים התאים עם 20% אימונוגלובולינים אנושיים במשך 3 דקות על קרח דגירה 0.1 x 10 6 aliquots תא עם Phycoerythrin (PerCP) -conjugated MAb נגד CD73, FITC מצומדות- MAb CD90, MAb PE-מצומדות נגד CD34 , FITC מצומדות- MAb CD45 וPE-מצומדות MAb CD105 עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס בחושך. התאמת אלוטיפ MAb מצומדות- FITC, MAb MAb andPerCP מצומדות- PE-מצומדות ישמש בקרות שליליות. לחשב את רמות הביטוי של סמני המשטח באמצעות תוכנה לאיסוף נתונים וניתוח. 5. תא הידבקות זיהוי על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים יש לשטוף את דגימות תאים-הדיסק ב 3 ימים של תרבות פעמיים עם PBSוfixthe דגימות עם glutaraldehyde 4% (V / V) solutionin 0.1 חיץ Na-cacodylate M (pH 7.2). הכן את הדגימות לתצפית מיקרוסקופית, כפי שדווח בעבר על ידי et al ריברה-N. 10 ולבחון באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בפוטנציאל חשמלי של 15 וולט ובהגדלה של 500X ו2000X. Assay הפצת נשק 6. Cell לדגימות תאים-דיסק המכילות 1.5 מיליליטר של מדיום התרבות, להוסיף 150 μl של צבען חיוני (AB) על פי הנחיות יצרן ולדגירת התאים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. מייד לאחר התוספת של AB (0 שעה) וכל שעה 24 עד שמגיעים 7 ימים של תרבית תאים, למדוד את הספיגה ב 570 ננומטר עם אורך גל של 600 ננומטר התייחסות. 7. יחידת יצירת מושבה (CFU) 11 לדיסקין תרבית רקמת 100 מ"מ HG-DMEM תרבות 100 תאי דגירה של 14ימים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. שטוף את התרבות עם PBS ואת הכתם עם 0.5% סגולים גביש במתנול למשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף את הצלחות עם PBS פעמיים ולספור את המושבות הגלויות באמצעות hemocytometer.