Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

Questa ricerca è stata effettuata in conformità con la dichiarazione dell'Associazione medica mondiale la di Helsinki per quanto riguarda la condotta etica della ricerca che coinvolge gli esseri umani ed è stato approvato dal Consiglio di Ricerca Etica Facultad de Medicina, UNAM (numero di progetto 101-2012). 1. Isolamento di mesenchimali umane Stem Cell Preparazione di reagente Preparare la soluzione tampone fosfato salino (PBS) e supplemento con soluzione antibiotica-antimicotica 1%. Preparare Dulbecco Modified mezzo di Eagle, alto glucosio (HG-DMEM), e aggiungere il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% solution.Sterilize antibiotico-antimicotico questo terreno di coltura per filtrazione con un filtro da 0,2 micron. Preparare una soluzione collagenasi II a 100 U / ml in HG-DMEM senza FBS o soluzione antibiotica-antimicotica. Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici, che sono necessari per l'isolamento, in autoclave: forbice di series, semplici dissettore, fine-point e pinza dentata e una maniglia bisturi (# 4). L'isolamento di cellule staminali mesenchimali di membrana amniotica umana Tenere il cordone ombelicale con una mano e con l'altra mano, staccare la membrana amniotica (AM), che si presenta come un foglio trasparente, per ottenere un frammento di circa 5 cm 2. Se la sezione corion è presente nel campione, separare il corion sottostante dalla dissezione manuale come sezione corion è più spesso del amnion. Rimuovere residui di sangue con tre lavaggi di 5 ml di PBS e rimuovere coaguli con semplici pinze. Fare un piccolo taglio al mattino con il bisturi per generare frammenti di circa 0,5 cm 2. Digestione enzimatica di membrana amniotica Incubare la AM con 5 ml di 0,125% tripsina / EDTA 0,5 mM soluzione a 37 ° C per 30 min in una provetta conica da 50 ml a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Centrifugare a 250xg e 25 ° C per 5 minuti e poi rimuovere la soluzione tripsina scartando il surnatante. Aggiungere 15 ml di soluzione di collagenasi tipo II e incubare per 2 ore a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%, con occasionale scuotitore secondo Leyva et al. 9 Subito dopo la digestione con collagenasi II, aggiungere 15 ml di PBS e centrifugare a 250 xg e 25 ° C per 10 min. Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 15 ml di soluzione di PBS e centrifugare a 250 xg e 25 ° C per 15 min. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di HG-DMEM agitando delicatamente. Espansione di cellule staminali mesenchimali Seed 2 ml di sospensione cellulare (1 x 10 4 cellule / cm 2) in pallone di coltura, e 2 ml di DMEM-HG e incubare le cellule a 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5%. Eliminare la cella non aderente cambiando il terreno di coltura dopo 5-7giorni. Trascorso questo tempo, cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni per altri 7-10 giorni per ottenere una confluenza cellulare del 90%. Recupero le cellule e incubare per 5 min a 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5% con soluzione di tripsina / EDTA 0,125% (tripsinizzazione). Subito dopo tripsinizzazione, raccogliere le cellule con una pipetta e trasferimento in un tubo da 15 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di HG-DMEM. Sospensione di coltura cellulare in due 75 centimetri 2 cultura palloni (5 ml in ogni pallone), e mantenere la cultura fino al 90% di confluenza. Ripetere i punti 1.4.3. a 1.4.6, fino al 9 passaggio o sottocultura. Recuperare le cellule di tripsinizzazione come in passaggi 1.4.3 a 1.4.5 per citometria a flusso o di altri studi. 2. Preparazione del Porous Bone Matrix Disk (NKB) Per bagnare i dischi NKB(Diametro 12 mm, spessore 2 mm)., Ogni disco incubare durante la notte con 3 ml di HG-DMEM senza FBS in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C, secondo Fassina et al 5 Dopo il processo di bagnatura, posizionare il disco in un tubo da 50 ml e centrifugare a 250 xg per 5 minuti per rimuovere terreno di coltura in eccesso. Posizionare il disco in una piastra di coltura cellulare 24 bene. Aggiungere 500 pl di HG-DMEM e incubare per 30 min a 25 ° C. Assicurarsi che non bolle sono presenti sul disco NKB per favorire la corretta distribuzione dei nutrienti e cellule. Se bolle si osservano sul disco, agitare e aggiungere 300 ml di terreno di coltura e incubare per 15 min in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Trascorso questo tempo togliere 300 ml di terreno di coltura succhiare attraverso la parete di coltura cellulare bene e confermano che si formano senza bolle. Posizionare il disco in un nuovo 24-pozzetti con pinze semplici. <p class= "Jove_title"> 3. Coltura di cellule staminali mesenchimali umane sul Matrix bovina poroso Seed una sospensione cellulare (5 x 10 5 AM-hMSCs in 100 ml di DMEM-HG) da tre subcolture, sulla superficie del disco biomateriale pre-umidificato e incubare per 30 min in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Eseguire questo passaggio lentamente e continuamente sulla faccia superiore del biomateriale per permettere alle cellule di interagire con la topografia di tutti scaffold. Nota: Questo procedimento il 60% delle cellule attaccate sul biomateriale indicato nella tabella 1. Aggiungere 1,5 ml di DMEM-HG a 37 ° C, e mantenere la coltura per 3 giorni in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Non generare turbolenze l'aggiunta di terreno di coltura per evitare che la deposizione di cellule sul fondo del piatto piastra di coltura. Questo è il tempo iniziale. 4. cellulare marcatori di superficie Caratterizzazione da flusso Cytommetria Staccare le celle da 9 ° sottocultura prima di seminare sul disco di matrice. Utilizzare 0,25% / 1 mM EDTA tripsina e fissarli per 30 minuti in ghiaccio-freddo 2% di formaldeide. Dopo la fissazione, lavare le cellule una volta con 0,05% PBS. Blocca legame non specifico incubando le cellule con il 20% immunoglobulina umana per 3 minuti su ghiaccio e incubare 0,1 x 10 6 aliquote di cellule con ficoeritrina (PerCP) -conjugated MAb contro CD73, FITC-coniugato MAb CD90, MAb PE-coniugato contro CD34 , FITC-coniugato MAb CD45 e PE-coniugato MAb CD105 per 1 ora a 25 ° C al buio. Isotype-abbinato FITC-coniugato MAb, PE-coniugato MAb andPerCP coniugato MAb servirà come controlli negativi. Calcolare i livelli di espressione dei marcatori di superficie utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati. 5. cellulare Detection Adesione da Scanning Electron Microscopy Sciacquare i campioni di cellule-disco in 3 giorni di cultura due volte con PBSe fixthe campioni con 4% (v / v) glutaraldeide solutionin un tampone 0,1 M Na-cacodilato (pH 7,2). Preparare i campioni per l'osservazione al microscopio, come precedentemente riportato da Rivera-N et al. 10 e osservare utilizzando un microscopio elettronico a scansione ad un potenziale elettrico di 15 kV e con un ingrandimento di 500X e 2000X. 6. Cell Proliferation Assay Per i campioni di cellule-disco contenenti 1,5 ml di terreno di coltura, aggiungere 150 ml di colorante vitale (AB) secondo le indicazioni del produttore e incubare le cellule in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Immediatamente dopo l'aggiunta di AB (0 ore) e ogni 24 ore fino a raggiungere 7 giorni di coltura cellulare, misurare l'assorbanza a 570 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 600 nm. 7. Colony Forming unità (CFU) 11 Cultura 100 cellule per ogni 100 mm di coltura tissutale Diskin HG-DMEM e incubare per 14giorni in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Lavare la cultura con PBS e macchia con 0,5% cristalvioletto in metanolo per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le piastre con PBS due volte e contare le colonie visibili con un emocitometro.