Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla<em> In Utero</em> Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Radyal göç erken kortikal gelişim merkezi bir süreçtir. Bu tür doğru mitotik çıkış ve nöronal farklılaşması, hücre polarite, sitoskeletal dinamikleri ve zar-ötesi reseptörlerin ekspresyonunun düzenlenmesini, hem de bu tür bir radyal glial iskele oluşumu olmayan hücre otonom faktörleri ve hücre otonom faktörler, çeşitli bağlıdır göçmen rehberlik salgılanması ^1-3 molekülleri. Bu mekanizmaların herhangi birinin bozulması beri karmaşık ve zor bir süreç olabilir göç bir kusur yatan nedenini belirlemek, bir transgenik fare modelinde ^4-8 nöronal göç bozabilir. Utero elektroporasyon (İEÜ) olarak tamamlayacak ve basitleştirmek için kullanılabilir böylece genetik knock-out model fenotip ve yorumlanması radyal göç ^7,9-11 için gerekli önemli mekanizmaları aydınlatmak.

Utero elektroporasyon (İEÜ) süreci olan bir plazmid carryi tarafından İlgili bir geni ve bir raportör hem ng bir fare veya sıçan embriyo beyninde ventrikül içine enjekte edilir ve daha sonra bir elektrik akımı ^12-14 kullanımı ile ventrikül astar hücreleri içine çekilir. Bu araştırmacı yukarı veya geliştirme ya da Electroporated nöronların fonksiyonu ilgi bir gen düzenlenmesi aşağı etkisini analiz etmeyi sağlar. İEÜ sonra, beyinleri immunohistokimyasal ^7,9-11, elektrofizyoloji ¹⁵ ya da hücre kültürü ^16,17 için işlenebilir. İEÜ büyük avantajı, bu gen ekspresyonunun yüksek oranda spesifik müdahale edilebilmesini sağlar olmasıdır. Ayrıca, İUE yönlendirilmiş bir akım (Şekil 2) boyunca gelişen beynin belirli bir bölgeyi hedef için kullanılabilir. İUE çeşitli promotörler ya da plazmid tahrik sistemleri kontrolü altındaki genleri taşıyan plazmid enjeksiyonu yoluyla, belirli bir hücre türü hedef için kullanılabilir ^10,18-21 (tetrasiklin ile uyarılan gen ifadesi bir örnektir).

> İUE Cre Lox aracılığıyla gen eksizyon sistemi ^7-9,11,22 ile bağlantılı olarak kullanılabilir jove_content ". Cre proteini için mesaj kodlayan bir gen içeren bir plazmid floxed alel için bir embriyo homozigot (elektroporasyona edilebilir olup, burada gen veya belirli DNA bölgeleri Cre aracılı DNA rekombinasyon, iki loxP sitelerinin) tarafından kuşatılmıştır. Cre daha sonra, spesifik elektroporasyona sinir ön ilgi konusu genin rekombinasyona neden olacaktır, ve floxed allele.The etkisinin bir knock-out üretilmesi sinir göç ve bireysel nöronlar içinde gelişimine demonte protein daha sonra incelenebilir. Cre Elektroporasyon sağlam destek ortamı terk etkilenen hücrelerin sadece küçük bir popülasyonda rekombinasyonu neden olur. Bunun tersine, belirli bir hücre tipinin kontrol altında Cre dokuya özgü sentezleme promotör, tüm dokusu boyunca meydana hem göç Nöroblastlar ve çevresini etkilenmiş olabileceğini. Böylece, Jux böyleceBu iki yaklaşımın taposition verilen göç kusur özerk ya da hücre dışı özerk mekanizmaları hücre bağlı olup olmadığını belirleyebilir. Her iki deneysel sistemlerde Arızalı göç anlaşılacağı bir hücre özerk mekanizması gözlemlenen fenotip sonuçları olduğunu; bir doku-spesifik Cre modelinde kusurlu göç Cre elektroporasyonu, aşağıdaki normal bir göç ilgi konusu gen, bir hücre olmayan bağımsız bir mekanizma yoluyla etki olduğunu gösterir.

İEÜ da nakavt hayvanlar ^7,9,10 içine potansiyel etkileşim genleri electroporating kurtarma deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir araştırmacı bir alt hedef electroporating ve göç kusur Electroporated nöronlar giderilmiştir ise belirleyerek bir transgenik modelinde bir göç fenotip kurtarmak için çalışabilir. Bu başarılı bir kurtarma normal bir göç SPE protein ifadesini manipüle tarafından restore edilebileceğini belirtir ek yararı vardır, spesifik nöron, çevredeki ortam hala hedeflenen gen için eksik olsa. Yine, bu yaklaşım daha fazla zaman ve kusurlu mekanizma hücre özerk olup olmadığını belirlemek yararı, transgenik çizgiler kapısı veya oluştururken daha maliyetli olduğunu.

İUE nakavt embriyolar (Şekil 4C) bir haberci plazmid elektroporasyonu yoluyla nöronlar göç izlemek için kullanılabilir. Ameliyat sırasında ventrikül astar sadece nöronlar ¹⁷ elektropore olarak, İEÜ in vivo morfolojisi görselleştirme avantajı ile belirli bir zamanda doğmuş nöronlar takip etmek için kullanılabilir.

Son olarak, bu tür orta veya dorsal telencephalon, hipokamp veya ganglionik eminensinden (Şekil 2) gibi beyin bölgeleri hedef IUE kullanmak mümkündür. Bu araştırmacılara komplikasyon sonuç belirli bir alanda bağımsız gen fonksiyonunu araştırmak için güç verirkomşu yapılarda demonte proteinden ing.

Retinoblastoma proteini (pRb), p107 ve p130 cep protein ailesini oluşturan ve iyi hücre döngüsü çıkış regülatörleri kurulmuştur. Bununla birlikte, bu proteinler, aynı zamanda, nöral gelişimi, hücre döngüsü bağımsız yönlerini düzenleyen dair artan kanıtlar vardır. Daha önce görüldüğü gibi, pRb ve p107 hem teğet ^4,23 ve radyal göç ⁶ önemli bir rol oynamaktadır. Burada, biz bir transgenik modeli Cre utero elektroporasyon kullanımını örneklendirmek için sinir göç ⁶ cep protein aile üyeleri pRb ve P107 rolünü göstermektedir. Özetle, İEÜ gen silme (veya aşırı ekspresyonu) hücre özerk etkilerini analiz güçlü bir yol sağlar. Modelleri nakavt özel dokusu ile kombine edildiğinde, İEÜ nöral göçü kontrol mekanizmaları ile ilgili ek bilgi sağlayabilir.