Индукция белка Удаление Через<em> В утробе матери</em> Электропорация Определить дефицит в миграции нейронов в трансгенных моделей

Радиальная миграция является центральный процесс начале развития коры. Это зависит от различных клеточных автономных факторов, таких как правильный выход митотической и нейрональной дифференцировки, клеточной полярности, регулирование динамики цитоскелета и экспрессии трансмембранных рецепторов, а также не-клеточных автономных факторов, таких как формирование радиальной глии строительные леса и секреция миграционной руководством молекул ^1-3. С нарушением какого-либо из этих механизмов может привести к ухудшению миграцию нейронов в трансгенной мыши модели ^4-8, определения основную причину дефекта в миграции может быть сложным и трудным процессом. Внутриутробное электропорации (ИЭГ) могут быть использованы для дополнения и упрощения интерпретация фенотипа генетического плей-модели и тем самым выяснить важные механизмы, необходимые для радиального миграции ^7,9-11.

Внутриутробное электропорации (ИЭГ) является процесс, при котором плазмида лай нг как представляющий интерес ген и репортеру вводят в желудочек головного мозга мыши или крысы эмбриона, а затем втягивается в клетках, выстилающих желудочек через использование электрического тока ^12-14. Это позволяет исследователю проанализировать эффект вверх или вниз регулирования гена в развитии или функции электропорации нейронов. После ИЭГ, мозги могут быть обработаны для иммуногистохимии ^7,9-11, электрофизиологии ¹⁵ или культуре клеток ^16,17. Основным преимуществом является то, что МСЭ в позволяет высокой удельной манипуляции экспрессии генов. Кроме того, Институт экономики города могут быть использованы для нацеливания на определенную область развивающегося мозга через направленной тока (рис 2). ИЭГ также могут быть использованы для нацеливания на определенную тип клеток за счет инъекции плазмид, несущих гены под контролем различных промоторов или систем активации плазмиду (тетрациклин индуцированной экспрессии гена, является примером) ^10,18-21.

jove_content "> ИЭГ может быть использован в сочетании с Cre-LOX опосредованного генного вырезания системы ^7-9,11,22. плазмиду, содержащую ген, кодирующий сообщение для белка Cre может быть электропорации в эмбрион, гомозиготных по аллелю (floxed в котором ген или ДНК конкретных областей примыкают два LoxP участков для Cre опосредованной рекомбинации ДНК). Cre затем индуцируют рекомбинацию интересующего гена в частности, в электропорации нейронных предшественников, создавая нокаут в floxed allele.The эффекта нокдаун белка на нейронной миграции и развития в отдельных нейронов могут быть изучены. Электропорация Cre вызывает рекомбинацию лишь в небольшом населения пораженных клеток, в результате чего опорную среду неповрежденными. В противоположность этому, конкретные ткани экспрессия Cre под контролем специфического типа клеток промоутер, происходит в течение всей ткани так, чтобы обе мигрирующих нейробластов и окружающая среда могут быть затронуты. Таким образом, Juxtaposition из этих двух подходов не может определить, является ли данный миграция дефект в связи с клеточно-автономными или сотовые неавтономных механизмы. Неисправный миграция в обеих экспериментальных системах о том, что результаты наблюдений фенотипа от А автономной клеточного механизма; нормальным миграции следующие электропорации Cre с дефектной миграции в ткани конкретной модели Cre означает, что интерес ген действует через автономную механизма без клеток.

ИЭГ также может быть использован для выполнения аварийно-спасательных эксперименты по электропорации потенциальных взаимодействующих генов в выбивают животных ^7,9,10. Например, следователь может попытаться спасти миграции фенотип трансгенных модели, электропорации нисходящего цели и определения, если дефект миграции корректируется в электропорации нейронов. Это имеет дополнительное преимущество, что успешное спасение указывает, что нормальная миграция может быть восстановлено путем манипулирования экспрессию белка в спеспецифичны нейронов, даже если окружающая среда по-прежнему недостаточно для целевого гена. Опять же, этот подход требует больше времени и экономически эффективным, чем пересечение или получения трансгенных линий, с дополнительным преимуществом определения наличия дефектных механизм клеточной автономно.

ИЭГ может использоваться для отслеживания миграции нейронов путем электропорации репортерной плазмиды в выбить эмбрионов (фиг.4С). Как только нейроны, выстилающие желудочка во время операции подвергали электропорации ^17, ИЭГ может использоваться, чтобы следовать нейронов, рожденных в определенный момент времени с преимуществом визуализации их морфологии в естественных условиях.

Наконец, можно использовать МСЭ целевой области мозга, такие как медиальной или спинной конечного мозга, гиппокампе или Ганглионарный бугорок (рисунок 2). Это дает исследователям право расследовать функции гена в конкретной области, независимо от осложнений результатчисле из белка нокдаун в соседних структур.

Белок ретинобластомы (PRB), p107 и p130 составляют семейство карманных белков и хорошо зарекомендовали себя регуляторы выхода из клеточного цикла. Тем не менее, появляется все больше доказательств того, что эти белки регулируют также клеточного цикла независимых аспекты развития нервной системы. Как мы уже показала, НРБ и p107 играют решающую роль как в тангенциальном ^4,23 и радиально миграции ^6. Здесь мы демонстрируем роль карман белка члены семьи PRB и P107 на нервной миграции ⁶ для иллюстрации использования в утробе матери электропорации Cre в трансгенной модели. Таким образом, Институт экономики города обеспечивает мощный способ анализа клеток автономные эффекты делеции гена (или избыточной экспрессии). В сочетании с конкретной выбить модели ткани ИЭГ может предоставить дополнительную информацию о механизмах, контролирующих нейронной миграции.