אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה<em> ברחם</em> Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים

הגירת רדיאלי היא תהליך מרכזי בהתפתחות קליפת המוח מוקדמת. זה תלוי במגוון גורמים אוטונומיים תא, כגון יציאה נכונה mitotic והבחנה עצבית, קוטביות תא, רגולציה של דינמיקת cytoskeletal וביטוי של קולטנים הטרנסממברני, כמו גם גורמים אוטונומיים שאינו תא, כגון היווצרות פיגום גליה רדיאלי ו הפרשת ההדרכה נודדת מולקולות ^1-3. מאז שיבוש של כל אחד ממנגנונים אלה יכולים לפגוע בהעברה עצבית במודל של עכברים מהונדס ^4-8, קביעת הסיבה הבסיסית של פגם בהגירה יכולה להיות תהליך מורכב וקשה. ברחם electroporation (IUE) ניתן להשתמש כדי להשלים ולפשט פרשנות של הפנוטיפ של מודל נוק-אאוט גנטי ובכך להבהיר מנגנונים חשובים הנדרשים להגירת רדיאלי ^7,9-11.

Electroporation ברחם (IUE) הוא התהליך שבו carryi פלסמיד ng שני גן של עניין וכתב מוזרק לתוך החדר במוח של עובר עכבר או חולדה ולאחר מכן נשאב לתוך התאים המצפים את החדר באמצעות שימוש ^12-14 זרם חשמלי. הדבר זה מאפשר לחוקר לנתח את ההשפעה של למעלה או למטה רגולציה של גן של עניין בפיתוח או פונקציה של נוירונים electroporated. בעקבות IUE, יכול להיות מעובד מוח אימונוהיסטוכימיה ^7,9-11, תרבות אלקטרופיזיולוגיה ¹⁵ או תא ^16,17. היתרון העיקרי של IUE הוא שהוא מאפשר למניפולציה מאוד ספציפית של ביטוי גנים. יתר על כן, IUE ניתן להשתמש כדי למקד לאזור מסוים של המוח המתפתח דרך נוכחי (איור 2) בבימויו. גם IUE יכול לשמש יעד סוג תא ספציפי באמצעות הזרקה של פלסמידים שנשאו גנים תחת שליטת יזמים שונים או מערכות הפעלת פלסמיד (ביטוי טטרציקלין מושרה גן הוא דוגמא) ^10,18-21.

jove_content "> IUE יכול לשמש בשילוב עם מערכת כריתת גן תיווך Cre-לקס ^7-9,11,22. פלסמיד המכיל גן המקודד את ההודעה לחלבון Cre ניתן electroporated להומוזיגוטים עובר לאלל floxed ( שבאזורי הגן או DNA ספציפי מוקף שני אתרי loxP לרקומבינציה DNA בתיווך Cre). לאחר מכן Cre יגרום רקומבינציה של הגן של עניין במיוחד במבשרים עצביים electroporated, שהניבו בנוק-אאוט של floxed allele.The ההשפעה אז יכול להיות למד חלבון מציאה על הגירה ופיתוח בתוך נוירונים בודדים עצביים. Electroporation של Cre גורמת רקומבינציה באוכלוסייה קטנה של תאים שנפגעו, עוזבת את הסביבה תומכת בשלמותה. בניגוד לכך, ביטוי רקמות הספציפיות של Cre תחת שליטה של ​​סוג תא מסוים אמרגן, מתרחש לאורך כל הרקמה, כך ששניהם neuroblasts הנודד והסביבה עלולים להיות מושפעים. כך, juxtaposition של שתי גישות אלה יכול לקבוע אם פגם הגירה ניתנה בשל תא מנגנונים שאינם אוטונומיים אוטונומיים או תא. הגירה פגומה בשתי מערכות הניסיוניות עולה כי תוצאות הפנוטיפ שנצפו ממנגנון אוטונומי תא; הגירה נורמלית הבא electroporation של Cre עם הגירה פגומה במודל Cre רקמות ספציפי מצביעה על כך שהגן של העניין פועל באמצעות מנגנון אוטונומי שאינו תא.

גם IUE ניתן להשתמש כדי לבצע ניסויי הצלה על ידי electroporating גני אינטראקציה פוטנציאליים לבעלי חיים לדפוק את ^7,9,10. לדוגמא, חוקר יכול לנסות להציל את הפנוטיפ הגירה במודל מהונדס על ידי electroporating יעד במורד הזרם וקביעה אם פגם ההגירה זו תוקן בנוירונים electroporated. זה יש יתרון נוסף שחילוץ מוצלח מצביע על כך שהגירה רגילה ניתן לשחזר על ידי המניפולציה ביטוי חלבון בSPEנוירון cific, למרות שהסביבה היא עדיין חסרה לגן הממוקד. שוב, גישה זו היא יותר זמן ועלות אפקטיבי מאשר חצייה או יצירת קווים מהונדסים, עם היתרון הנוסף של קביעה אם המנגנון הפגום הוא תא אוטונומי.

IUE ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר נדידת נוירונים דרך electroporation של פלסמיד כתב לעוברי לדפוק את (איור 4C). כמו שרק תאי העצב המרפדים את החדר בזמן הניתוח הם electroporated ^17, IUE יכול לשמש למעקב נוירונים נולדו בזמן מסוים עם היתרון של הדמיה של המורפולוגיה שלהם in vivo.

לבסוף, ניתן להשתמש IUE למקד אזורים במוח כגון telencephalon המדיאלי או גב, היפוקמפוס או רוממות ganglionic (איור 2). זה נותן לי חוקרי הכח לחקור את תפקוד גן בעצמאי אזור מסוים של סיבוכי תוצאה רצוייםing מחלבון מציאה במבנים שכנים.

חלבון רטינובלסטומה (PRB), p107 וp130 מרכיבים את משפחת חלבון כיס ומבוסס היטב רגולטורים של יציאת מחזור התא. עם זאת, יש ראיות גוברת שחלבונים אלה גם להסדיר היבטים עצמאיים מחזור התא של התפתחות עצבית. כפי שהראינו בעבר, גדוד המשטרה וp107 לשחק תפקיד מכריע בשני ^4,23 המשיקים וההגירה רדיאלי ^6. הנה, אנחנו מדגימים את התפקיד של גדוד משטרת בני משפחת חלבון הכיס וp107 על הגירה עצבית ⁶ כדי להדגים את השימוש בelectroporation ברחם של Cre במודל מהונדס. לסיכום, IUE מספק דרך רבת עוצמה של ניתוח השפעות אוטונומיות תא של מחיקת גן (או ביטוי יתר). בשילוב עם רקמה ספציפית לדפוק את מודלים, IUE יכול לספק מידע נוסף בנוגע למנגנוני השליטה הגירה עצבית.