L'induzione di proteine ​​Cancellazione Through<em> In Utero</em> Elettroporazione per definire deficit in migrazione neuronale in modelli transgenici

Migrazione Radial è un processo fondamentale per primo sviluppo corticale. Essa dipende da una varietà di fattori cellulari autonomi, come uscita corretta mitosi e la differenziazione neuronale, polarità cellulare, regolazione della dinamica del citoscheletro e l'espressione dei recettori transmembrana, così come non-cellulari fattori autonomi, come la formazione del ponteggio gliali radiali e secrezione di orientamento migratorio molecole ^1-3. Poiché rottura di uno di questi meccanismi può compromettere migrazione neuronale in un modello di topo transgenico ^4-8, determinare la causa di fondo di un difetto di migrazione può essere un processo complesso e difficile. In utero elettroporazione (IUE) può essere utilizzato per integrare e semplificare interpretazione del fenotipo di un modello knock-out genetico e quindi chiarire i meccanismi importanti necessari per la migrazione radiale ^7,9-11.

In utero elettroporazione (IUE) è il processo mediante il quale un carryi plasmide ng sia un gene di interesse e un reporter viene iniettato nel ventricolo nel cervello di un topo o ratto embrionale e quindi trascinato nelle cellule che rivestono il ventricolo attraverso l'uso di una corrente elettrica ^12-14. Questo permette al ricercatore di analizzare l'effetto di alto o in basso regolazione di un gene di interesse per lo sviluppo o la funzione dei neuroni elettroporate. Dopo IUE, il cervello possono essere trattati per immunoistochimica ^7,9-11, elettrofisiologia ¹⁵ o coltura cellulare ^16,17. Il principale vantaggio di IUE è che si permette la manipolazione altamente specifica dell'espressione genica. Inoltre, IUE può essere utilizzato per mirare ad una regione specifica del cervello sviluppo attraverso una corrente diretta (Figura 2). IUE può anche essere utilizzato per mirare ad un tipo di cellula specifico mediante iniezione di plasmidi che trasportano geni sotto il controllo di vari promotori o sistemi di attivazione plasmide (tetraciclina indotta l'espressione del gene è un esempio) ^10,18-21.

jove_content "> IUE può essere utilizzato in combinazione con il sistema di escissione gene mediato Cre-Lox ^7-9,11,22. Un plasmide contenente un gene che codifica il messaggio per la proteina Cre può essere elettroporate in un embrione omozigote per l'allele floxed ( in cui le regioni del gene o DNA specifico sono fiancheggiate da due siti loxP per Cre mediata ricombinazione DNA). Cre quindi indurrà ricombinazione del gene di interesse specifico dei precursori neuronali elettroporate, generando un knock-out della floxed allele.The effetto proteine ​​atterramento sulla migrazione neuronale e lo sviluppo all'interno dei singoli neuroni può essere studiata. elettroporazione di Cre induce ricombinazione in solo una piccola popolazione di cellule colpite, lasciando intatto l'ambiente di supporto. Al contrario, l'espressione tessuto specifico di Cre sotto il controllo di un tipo di cellula specifico promotore, si verifica durante tutto il tessuto in modo che entrambi neuroblasti migrano e l'ambiente circostante potrebbero essere influenzate. Pertanto, juxtaposition di questi due approcci può determinare se una data difetto di migrazione è dovuta alla cella meccanismi non autonomi autonomi o cellulari. Migrazione difettoso in entrambi i sistemi sperimentali suggeriscono che i risultati fenotipo osservati da un meccanismo autonomo di cellule; migrazione normale dopo elettroporazione di Cre migrazione difettoso in un modello specifico Cre tessuto indica che il gene di interesse agisce attraverso un meccanismo autonomo non-cellula.

IUE può anche essere usato per eseguire esperimenti di soccorso da electroporating potenziali geni interagiscono in knock out animali ^7,9,10. Ad esempio, un ricercatore potrebbe tentare di salvare un fenotipo migrazione in un modello transgenico da electroporating un bersaglio a valle e determinare se il difetto di migrazione viene corretto in neuroni elettroporate. Questo ha il vantaggio aggiuntivo che un salvataggio di successo indica che la migrazione normale può essere ripristinato manipolando l'espressione della proteina in una specifica neurone, anche se l'ambiente circostante è ancora carente per il gene bersaglio. Ancora una volta, questo approccio è più tempo e conveniente che attraversa o generare linee transgeniche, con il vantaggio di determinare se il meccanismo è difettoso cellule autonoma.

IUE può essere utilizzato per monitorare la migrazione dei neuroni attraverso elettroporazione di un plasmide giornalista in knock out embrioni (Figura 4C). Poiché solo i neuroni che rivestono il ventricolo al momento dell'intervento chirurgico sono elettroporate ^17, IUE può essere utilizzata per seguire i neuroni nati in un momento specifico con il vantaggio di visualizzazione della loro morfologia in vivo.

Infine, è possibile utilizzare per indirizzare IUE regioni cerebrali come la telencefalo mediale o dorsale, ippocampo o eminenza gangliare (Figura 2). Questo dà ricercatori il potere di indagare la funzione del gene in una determinata area indipendente complicazioni risultatoing da proteine ​​atterramento in strutture vicine.

Proteina retinoblastoma (pRb), P107 e P130 comprendono la famiglia di proteine ​​tasca e sono ben regolatori del ciclo cellulare uscita stabilita. Tuttavia, vi è una crescente evidenza che queste proteine ​​regolano anche del ciclo cellulare aspetti indipendenti di sviluppo neurale. Come abbiamo già dimostrato, pRb e P107 svolgono un ruolo cruciale sia in tangenziale ^4,23 e migrazione radiale ^6. Qui, dimostriamo il ruolo della proteina tasca familiari pRb e P107 sulla migrazione neuronale ⁶ per esemplificare l'uso di elettroporazione in utero di Cre in un modello transgenico. In sintesi, IUE fornisce un modo potente di analizzare cellule effetti autonome di delezione del gene (o sovraespressione). Se combinato con tessuto specifico knock out modelli, IUE può fornire ulteriori informazioni riguardanti i meccanismi che controllano la migrazione neuronale.