تحريض حذف البروتين من خلال<em> في الرحم</em> Electroporation لللتحديد العجز في العصبية الهجرة في النماذج المعدلة وراثيا
Summary
Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.
Abstract
حذف الوراثي باستخدام نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن في خطوط الماوس المعدلة وراثيا هو أداة قوية تستخدم لدراسة وظيفة البروتين. ومع ذلك، إلا في نماذج محددة للغاية لجنة المساواة العرقية، الحذف من البروتين طوال السكان الأنسجة أو الخلايا غالبا ما يؤدي إلى الظواهر المعقدة الناجمة عن آليات التفاعل متعددة. تحديد ما إذا كانت النتائج النمط الظاهري من تعطل آلية مستقلة خلية، وهو جوهري إلى الخلية في السؤال، أو من آلية مستقلة غير الخلية، التي من شأنها أن تنجم عن ضعف البيئة تلك الخلية، ويمكن أن يكون من الصعب تمييز. للحصول على نظرة ثاقبة وظيفة البروتين في سياق في الجسم الحي، في الرحم Electroporation لل(IUE) يتيح حذف الجينات في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا داخل القشرة تطوير أو بعض منطقة في الدماغ مختارة أخرى. يمكن أن تستخدم IUE لاستهداف مناطق محددة في الدماغ، بما في ذلك الدماغ الانتهائي الظهرية، الدماغ الانتهائي وسطي، الحصين، أو البارزة العقدية. وهذا يسهل س الملاحظةو عواقب خلية مستقلة حذف الجينات في سياق بيئة صحية. والهدف من هذا البروتوكول هو لاظهار كيف يمكن استخدام IUE لتحليل وجود خلل في الهجرة شعاعي في خط الماوس المعدلة وراثيا floxed، مع التأكيد على التمييز بين الخلية آثار الحكم الذاتي مستقلة وغير خلية من البروتين الحذف. بمقارنة النمط الظاهري الناتج عن حذف الجينات داخل القشرة بأكملها مقابل IUE بوساطة حذف الجينات في خلية السكان محدود، مزيد من التبصر في وظيفة البروتين في نمو الدماغ ويمكن الحصول من استخدام إما تقنية في عزلة.
Introduction
الهجرة الشعاعية هي عملية مركزية في التنمية القشرية في وقت مبكر. ذلك يعتمد على مجموعة متنوعة من العوامل خلية مستقلة، مثل الصحيح للخروج الإنقسامية وتمايز الخلايا العصبية، الخلايا القطبية، وتنظيم ديناميات هيكل الخلية والتعبير عن مستقبلات عبر الغشاء، فضلا عن عدم خلية العوامل المستقلة، مثل تشكيل سقالة الدبقية شعاعي و إفراز التوجيه المهاجرة جزيئات 1-3. منذ تعطل أي من هذه الآليات يمكن أن يعوق هجرة الخلايا العصبية في نموذج الفأر المعدلة وراثيا 4-8، وتحديد السبب الكامن وراء وجود خلل في الهجرة يمكن أن يكون عملية معقدة وصعبة. في الرحم Electroporation لل(IUE) يمكن استخدامها لاستكمال وتبسيط تفسير النمط الظاهري من نموذج الجيني خروج المغلوب، وبالتالي توضيح الآليات الهامة المطلوبة للهجرة شعاعي 7،9-11.
في الرحم Electroporation لل(IUE) هو العملية التي من carryi بلازميد نانوغرام كل من الجينات في المصالح ومراسل يتم ضخها في البطين في دماغ فأر أو جرذ الجنين ومن ثم رسمها في الخلايا المبطنة للبطين من خلال استخدام تيار كهربائي 12-14. وهذا يسمح للمحقق لتحليل تأثير أعلى أو لأسفل التنظيم من الجينات في المصالح في التنمية أو وظيفة الخلايا العصبية electroporated. وبعد IUE، والعقول يمكن معالجتها لالمناعية 7،9-11، الكهربية 15 أو خلية الثقافة 16،17. والميزة الرئيسية لIUE هي التي تسمح للتلاعب محددة للغاية في التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم IUE لاستهداف منطقة محددة من الدماغ النامية من خلال توجه الحالي (الشكل 2). ويمكن أيضا أن تستخدم IUE لاستهداف نوع خلية معينة من خلال حقن البلازميدات تحمل الجينات تحت سيطرة المروجين مختلف أو الأنظمة تفعيل بلازميد (التتراسيكلين الناجم عن التعبير الجيني هو مثال) 10،18-21.
jove_content "> IUE يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن الجينات بوساطة نظام الختان 7-9،11،22. يمكن electroporated البلازميد التي تحتوي على الجين ترميز الرسالة للبروتين لجنة المساواة العرقية إلى متماثلة اللواقح الجنين لأليل floxed ( التي يتم يحيط المناطق الجينات أو الحمض النووي محددة من قبل اثنين من المواقع loxP لجنة المساواة العرقية بوساطة إعادة التركيب DNA). سوف لجنة المساواة العرقية ثم لحث على إعادة التركيب من الجينات في المصالح وتحديدا في السلائف العصبية electroporated، وتوليد الضربة القاضية للخروج من floxed allele.The تأثير البروتين ضربة قاضية على الهجرة العصبية والتنمية داخل الخلايا العصبية الفردية يمكن بعد ذلك درس. Electroporation للمن لجنة المساواة العرقية يدفع إعادة التركيب إلا في عدد صغير من السكان خلايا المصابة، وترك البيئة الداعمة سليمة. في المقابل، التعبير أنسجة معينة من لجنة المساواة العرقية تحت السيطرة من نوع خلية معينة المروج، يحدث في جميع أنحاء الأنسجة كامل بحيث أن كلا neuroblasts المهاجرة والبيئة المحيطة يمكن أن تتأثر. وهكذا، juxtaposition من هذين النهجين يمكن تحديد ما إذا كان هو عيب الهجرة نظرا يرجع إلى الخلية آليات غير المتمتعة بالحكم الذاتي أو الحكم الذاتي الخلية. الهجرة المعيبة في كل من النظم التجريبية تشير إلى أن النتائج النمط الظاهري المرصودة من آلية خلية مستقلة. الهجرة العادية التالية Electroporation للمن لجنة المساواة العرقية مع الهجرة المعيبة في نموذج محدد لجنة المساواة العرقية الأنسجة تشير إلى أن الجينات في المصالح يتصرف من خلال آلية غير خلية مستقلة.ويمكن أيضا أن تستخدم لIUE إجراء تجارب الانقاذ electroporating الجينات تتفاعل المحتملة في ضرب الحيوانات 7،9،10. على سبيل المثال، يمكن أن محقق محاولة لانقاذ النمط الظاهري الهجرة في نموذج المعدلة وراثيا التي كتبها electroporating هدفا المصب وتحديد ما إذا كان يتم تصحيح الخلل الهجرة في الخلايا العصبية electroporated. وهذا له فائدة إضافية أن انقاذ ناجحة يشير إلى أن الهجرة العادية يمكن استعادة عن طريق التلاعب البروتين التعبير في جمعية مهندسي البترولمحدَّدة الخلايا العصبية، على الرغم من أن البيئة المحيطة لا تزال قاصرة عن الجينات المستهدفة. مرة أخرى، وهذا النهج هو المزيد من الوقت وفعالة من حيث التكلفة من عبور أو توليد خطوط المعدلة وراثيا، مع فائدة إضافية تتمثل في تحديد ما إذا كانت آلية المعيبة هي خلية مستقلة.
IUE يمكن استخدامها لتتبع هجرة الخلايا العصبية من خلال Electroporation للمن البلازميد مراسل في ضرب الأجنة (الشكل 4C). كما فقط الخلايا العصبية تبطن البطين في وقت الجراحة وelectroporated 17، IUE يمكن استخدامها لتتبع الخلايا العصبية ولدوا في وقت محدد مع الاستفادة من التصور من التشكل في الجسم الحي.
وأخيرا، فمن الممكن استخدام IUE لاستهداف مناطق الدماغ مثل الدماغ الانتهائي وسطي أو الظهرية، الحصين أو البارزة العقدية (الشكل 2). وهذا يعطي الباحثين القدرة على تحقيق وظيفة الجين في منطقة مستقلة محدد من مضاعفات نتائج لجي من البروتين ضربة قاضية في الهياكل المجاورة.
البروتين الشبكية (PRB)، P107 P130 وتتكون الأسرة من البروتين جيب وراسخة المنظمين للدورة الخلية الخروج. ومع ذلك، هناك أدلة متزايدة على أن هذه البروتينات أيضا تنظيم دورة الخلية جوانب مستقلة من التطور العصبي. كما بينا سابقا، وPRB P107 تلعب دورا حاسما في كل من عرضية 4،23 والهجرة شعاعي 6. هنا، علينا أن نظهر دور البروتين جيب أفراد الأسرة PRB وP107 على الهجرة العصبية 6 لتجسيد استخدام في الرحم Electroporation للمن لجنة المساواة العرقية في نموذج المعدلة وراثيا. وباختصار، IUE يوفر وسيلة قوية لتحليل الخلايا آثار الحكم الذاتي في حذف الجينات (أو overexpression). عندما جنبا إلى جنب مع أنسجة محددة ضرب النماذج، يمكن IUE تقديم معلومات إضافية بشأن آليات السيطرة على الهجرة العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
اثنين من التحديات الرئيسية في أداء في electroporations الرحم هي 1) منع الفتك الجنين و2) تقليل التباين بين electroporations. واحدة من أهم العوامل في منع الفتك هو نوعية الإبرة، والإبر غير حادة تلحق المزيد من الضرر للجنين. عندما قطع الإبرة، والحفاظ على طرف لأطول فترة ممكنة في حي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.
Materials
| Table 1: Equipment and Materials | ||||
| Product Name | Company | Catalog Number | Description | |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) | |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation | |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes | |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector | |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle | |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube | |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet | |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection | |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes | |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles | |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight | |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | ||
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips | |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock | |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries | |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes | |
References
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
- Wu, Q., et al. The dynamics of neuronal migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).
- McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
- Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
- Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
- Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
- Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
- Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
- Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
- Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. targeting in mice: a review. Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).
- Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
- Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
- Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
- Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .
- Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. . Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).
