Induktion der Protein Deletion Durch<em> In Utero</em> Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Radial Migration ist ein zentraler Prozess zur frühen kortikalen Entwicklung. Es hängt von einer Vielzahl von Zell autonomen Faktoren wie korrekte mitotischen Ausfahrt und die neuronale Differenzierung, Zellpolarität, die Regulierung des Zytoskeletts und die Expression des Transmembran-Rezeptoren, wie auch nicht-zell autonomen Faktoren, wie die Bildung von radialen Gliazellen Gerüst und Sekretion der Migrationsberatung Moleküle ^1-3. Da Störungen einer dieser Mechanismen neuronaler Migration in einem transgenen Mausmodell ^4-8 In utero Elektroporation (IUE) beeinträchtigt, die Bestimmung der Ursache eines Fehlers in der Migration kann ein komplexer und schwieriger Prozess sein. Kann verwendet werden, zu ergänzen und zu vereinfachen Interpretation des Phänotyps einer genetischen Knock-out-Modells und damit wichtige Mechanismen aufzuklären radiale Migration ^7,9-11 erforderlich.

In utero Elektroporation (IUE) ist der Vorgang, bei dem ein Plasmid carryi ng sowohl ein Gen von Interesse und ein Reportergen in die Ventrikel des Gehirns eines Maus oder Rattenembryo injiziert und dann in die Zellen der Herzkammer durch Anwendung eines elektrischen Stroms ^12-14 gezogen. Dies ermöglicht dem Prüfer, die Wirkung der nach oben oder unten Regulation eines Gens von Interesse in der Entwicklung oder Funktion elektroporiert Neuronen zu analysieren. Nach IUE können Gehirne für die Immunhistochemie ^7,9-11, Elektrophysiologie ¹⁵ oder Zellkultur ^16,17 verarbeitet werden. Der große Vorteil ist, dass IUE wird ermöglicht hochspezifische Manipulation der Genexpression. Weiterhin kann IUE verwendet, um einen bestimmten Bereich des sich entwickelnden Gehirns durch einen gerichteten Strom (Abbildung 2) zu zielen. IUE können auch verwendet werden, um einen spezifischen Zelltyp, durch Injektion von Plasmiden, die Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder Plasmid Aktivierungssysteme abzuzielen (Tetracyclin induzierte Genexpression ist ein Beispiel) ^10,18-21.

jove_content "> IUE kann in Verbindung mit dem Cre-Lox-vermittelten Gen Exzision System ^7-9,11,22 verwendet werden. kann ein Plasmid, das ein Gen, das die Nachricht für die Cre-Protein kodiert, in einen Embryo homozygot für das Allel floxed (elektroporiert werden in denen das Gen oder spezifische DNA-Regionen werden durch zwei loxP-Stellen für Cre-vermittelte DNA-Rekombination) flankiert. Cre dann induzieren Rekombination des Gens von Interesse spezifisch in elektroporiert neuralen Vorläuferzellen, Erzeugen eines Knock-out des floxed allele.The Wirkung Protein auf neuronale Migration und Entwicklung in einzelnen Neuronen Knockdown kann dann untersucht werden. Die Elektroporation von Cre Rekombination induziert in nur einer kleinen Population von betroffenen Zellen, so dass die Unterstützung von Umwelt intakt. Im Gegensatz dazu gewebespezifische Expression von Cre unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotor, tritt während des gesamten Gewebes, so daß beide Migration Neuroblasten und der Umgebung beeinträchtigt werden. So juxtaposition dieser beiden Ansätze können bestimmen, ob ein bestimmter Migrationsdefekt aufgrund autonomer oder Zell nicht autonomen Mechanismen der Zelle ist. Defekte Migration in beiden experimentellen Systemen legt nahe, dass die beobachteten Phänotyp resultiert aus einer Zelle autonom Mechanismus; normaler Migrations nach Elektroporation von Cre mit defekten Migration auf eine gewebespezifische Cre Modell zeigt, dass das Gen von Interesse durch eine nicht-zell autonomen Mechanismus wirkt.

IUE kann auch verwendet werden, um Rettungsversuche durch Elektroporation potenzielle Interaktion von Genen in Knock-out-Tiere ^7,9,10 durchzuführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher versucht, eine Migration Phänotyp in einer transgenen Modells durch Elektroporation ein stromabwärtiges Ziel und Bestimmen, ob die Migration Defekt in elektroporierten Neuronen korrigiert retten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass ein erfolgreicher Rettungs zeigt an, daß normale Migration kann durch Manipulieren der Proteinexpression in einer spe wiederhergestelltsche Neuron, obwohl die Umgebung noch defizient Zielgens. Wiederum ist dieser Ansatz mehr Zeit und kostengünstiger als die Kreuzung oder transgene Linien, mit dem zusätzlichen Vorteil der Bestimmung, ob der defekte Mechanismus Zelle autonom.

IUE verwendet werden, um die Migration zu verfolgen Neuronen durch Elektroporation von einem Reporter-Plasmid in Knock-out-Embryonen (4C) werden. Da nur die Neuronen Auskleidung der Herzkammer zu der Zeit der Operation werden elektroporiert ¹⁷ kann IUE verwendet, um die Nervenzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem Vorteil der Visualisierung ihrer Morphologie in vivo geboren folgt.

Schließlich ist es möglich, IUE wie der medialen oder dorsalen Telencephalon, Hippocampus oder Ganglienhügel (Abbildung 2) zu verwenden, um Hirnregionen gezielt. Dies gibt Forschern die Möglichkeit Genfunktion in einem bestimmten Bereich unabhängig von Komplikationen zu untersuchendie sich aus Protein in benachbarten Strukturen Knockdown.

Retinoblastom Protein (pRb), p107 und p130 umfassen die Tasche Proteinfamilie und sind gut etabliert Regulatoren des Zellzyklus zu beenden. Allerdings gibt es immer mehr Anzeichen dafür, dass diese Proteine ​​des Zellzyklus unabhängige Aspekte der neuralen Entwicklung regulieren auch. Wie wir bereits gezeigt haben, pRb und p107 spielen eine entscheidende Rolle in beiden tangentialen ^4,23 und radiale Migration ^6. Hier zeigen wir die Rolle der Tasche Proteinfamilienmitglieder pRb und p107 neuronaler Migration ^6, den Einsatz von in utero Elektroporation von Cre in einem transgenen Modell veranschaulichen. Zusammengefasst stellt IUE eine leistungsfähige Möglichkeit zum Analysieren Zelle autonom Wirkungen der Gen-Deletion (oder Überexpression). Wenn mit gewebespezifischen Knock-out-Modelle kombiniert werden, können IUE zusätzliche Informationen über die Mechanismen, die neuronale Migration bieten.