Indução da Eliminação Proteína Através<em> In Utero</em> Eletroporação para definir défices de Migração Neuronal em modelos transgênicos

Migração radial é um processo fundamental para o desenvolvimento cortical precoce. Ele depende de uma variedade de factores celulares autónomos, tais como saída correcta mitótico e diferenciação neuronal, da polaridade celular, regulação da dinâmica do citoesqueleto e expressão de receptores transmembranares, bem como não-celulares factores autónomos, tais como a formação do andaime glial radial e secreção de orientação migratória moléculas ^1-3. Uma vez que a interrupção de qualquer destes mecanismos pode prejudicar a migração neuronal num modelo de ratinho transgénico ^4-8, determinando a causa subjacente a um defeito na migração pode ser um processo complexo e difícil. No útero electroporação (IUE) pode ser utilizado para complementar e simplificar interpretação do fenótipo de um modelo genético de knock-out e assim elucidar mecanismos importantes necessários para a migração radial ^7,9-11.

No útero electroporação (IUE) é o processo pelo qual um plasmídeo carryi ng tanto um gene de interesse e um repórter é injectado no ventrículo do cérebro de um embrião de ratinho ou de rato e, em seguida, arrastada para as células que revestem o ventrículo através da utilização de uma corrente eléctrica ^12-14. Isto permite ao investigador para analisar o efeito de cima ou para baixo regulação de um gene de interesse no desenvolvimento ou função de neurónios electroporadas. Seguindo IUE, cérebros podem ser processados ​​por imuno-histoquímica ^7,9-11, eletrofisiologia ¹⁵ ou cultura celular ^16,17. A principal vantagem da IUE é que permite a manipulação é altamente específica da expressão do gene. Além disso, IUE pode ser utilizado como alvo uma região específica do cérebro em desenvolvimento por meio de uma corrente dirigida (Figura 2). IUE também pode ser utilizado para atingir um tipo de célula específico através da injecção de plasmídeos que transportam os genes sob o controle de diferentes promotores ou sistemas de activação plasmídeo (expressão do gene da tetraciclina é induzido um exemplo) ^10,18-21.

jove_content "> IUE pode ser usado em conjunto com o sistema de excisão de genes mediada por Cre-Lox ^7-9,11,22. Um plasmídeo contendo um gene que codifica a mensagem para a proteína Cre pode ser electroporada em um embrião homozigótica para o alelo floxed ( em que as regiões do gene ou ADN específicas estão flanqueados por dois locais loxP para recombinação de ADN mediada Cre). Cre irão então induzir a recombinação do gene de interesse, especificamente em precursores neuronais electroporadas, gerando um knock-out do efeito de floxed allele.The proteína knockdown sobre migração e desenvolvimento dentro dos neurônios individuais neural pode então ser estudado. Eletroporação de Cre induz recombinação em apenas uma pequena população de células afetadas, deixando o ambiente de suporte intacta. Em contraste, a expressão tecido específico de Cre sob o controle de um tipo específico de célula promotor, ocorre ao longo de todo o tecido, de modo que ambos os neuroblastos migram e o ambiente circundante poderia ser afectada. Assim, juxtaposition dessas duas abordagens podem determinar se um determinado defeito migração é devido à célula mecanismos não-autónomos autônomos ou celulares. Migração com defeito em ambos os sistemas experimentais sugerem que o fenótipo resultados observados de um mecanismo autônomo celular; migração normal após a electroporação de Cre com migração defeituoso em um modelo Cre específica para tecidos indica que o gene de interesse está a actuar através de um mecanismo autónomo não-célula.

IUE também pode ser usado para realizar experimentos de resgate por electroporating potenciais genes que interagem em knock out animais ^7,9,10. Por exemplo, um investigador poderia tentar recuperar um fenótipo migração num modelo transgénico por electroporating um alvo a jusante e determinar se o defeito de migração é corrigida nos neurónios electroporadas. Isto tem a vantagem adicional de que um resgate com êxito indica que a migração normal pode ser restaurada através da manipulação de expressão de proteína numa specas neurónio, embora o ambiente circundante é ainda deficiente para o gene alvo. Mais uma vez, esta abordagem é mais tempo e de custo eficaz do que cruzar ou a geração de linhagens transgênicas, com o benefício adicional de determinar se o mecanismo defeituoso é célula autônoma.

IUE pode ser usado para controlar a migração de neurónios através de electroporação de um plasmídeo repórter em knock out embriões (Figura 4C). Como apenas os neurónios que revestem o ventrículo no momento da cirurgia são electroporadas ^17, IUE pode ser usado para seguir os neurónios carregados em um momento específico, com a vantagem da visualização da sua morfologia in vivo.

Finalmente, é possível utilizar IUE alvo regiões do cérebro tais como o telencéfalo ou medial dorsal, hipocampo ou eminência ganglionar (Figura 2). Isso dá aos pesquisadores o poder de investigar a função do gene em um independente de complicações resultado específico áreaPasso da proteína knockdown em estruturas vizinhas.

Proteína do retinoblastoma (pRb), p107 e p130 compreendem a família de proteínas de bolso e são bem reguladores de saída do ciclo celular estabelecida. No entanto, há evidências crescentes de que estas proteínas regulam também aspectos independentes do ciclo celular de desenvolvimento neural. Como mostramos anteriormente, pRb e p107 desempenham um papel crucial em ambos tangencial ^4,23 e migração radial ^6. Aqui, demonstramos o papel da proteína de bolso pRb e membros da família p107 sobre a migração neuronal ⁶ para exemplificar o uso de electroporação in utero de Cre num modelo transgénico. Em resumo, IUE fornece uma maneira poderosa de analisar os efeitos de células autônomas de deleção do gene (ou sobre-expressão). Quando combinado com tecido específico nocautear modelos, IUE pode fornecer informações adicionais sobre os mecanismos que controlam a migração neural.