Inductie van Eiwit van de verwijdering door<em> In Utero</em> Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen

Radial migratie is een centraal proces om vroege corticale ontwikkeling. Het hangt van verschillende cel autonome factoren, zoals de juiste mitotische uitgang en neuronale differentiatie, celpolariteit, regulatie van het cytoskelet dynamiek en expressie van transmembraan receptoren, evenals niet-cell autonome factoren, zoals de vorming van de radiale gliale steiger en secretie van trekkende begeleiding moleculen ^1-3. Aangezien verstoring van elk van deze mechanismen neuronale migratie beïnvloeden in een transgeen muismodel ^4-8, bepalen de onderliggende oorzaak van een defect in migratie kan een complexe en moeilijk proces. In utero elektroporatie (IUE) kan worden gebruikt in aanvulling en vereenvoudigen interpretatie van het fenotype van een genetische knock-out systeem en daarmee toe te lichten belangrijke mechanismen die nodig zijn voor radiale migratie ^7,9-11.

In de baarmoeder elektroporatie (IUE) is het proces waarbij een plasmide carryi ng zowel een gen van interesse en een reporter wordt geïnjecteerd in de ventrikel in de hersenen van een muis of rat embryo en vervolgens getrokken in de epitheelcellen van de ventrikel met gebruikmaking van een elektrische stroom ^14/12. Hierdoor kan de onderzoeker het effect van omhoog of omlaag regulatie van een gen van interesse in de ontwikkeling en functie van geëlektroporeerd neuronen te analyseren. Volgende IUE, kunnen de hersenen worden verwerkt voor immunohistochemie ^7,9-11, elektrofysiologie ¹⁵ of celkweek ^16,17. Het grote voordeel van IUE is die zorgt voor zeer specifieke manipulatie van genexpressie. Bovendien kan IUE worden gebruikt om een specifiek gebied van de ontwikkelende hersenen richten via een gerichte stroom (figuur 2). IUE kan ook worden gebruikt om een bepaald celtype door injectie van plasmiden dragen genen onder controle van verschillende promotors of plasmide activatie doelsystemen (tetracycline geïnduceerde genexpressie een voorbeeld) ^10,18-21.

jove_content "> IUE kan worden gebruikt in combinatie met het Cre-Lox-gemedieerde gen-excisie systeem ^7-9,11,22. Een plasmide dat een gen coderend voor het bericht voor het Cre eiwit worden geëlektroporeerd in een embryo homozygoot voor het floxed allel ( waarbij het ​​gen of specifieke DNA-gebieden worden geflankeerd door twee loxP plaatsen voor Cre gemedieerde DNA-recombinatie). Cre dan recombinatie van het gen van interesse te induceren specifiek geëlektroporeerde neurale precursoren, het genereren van een knock-out van het floxed allele.The effect van proteïne knockdown op neurale migratie en ontwikkeling in individuele neuronen kunnen vervolgens onderzocht worden. Elektroporatie van Cre recombinatie veroorzaakt slechts een kleine populatie van aangetaste cellen, waardoor de ondersteunende omgeving intact. Daarentegen weefselspecifieke expressie van Cre onder controle van een celtype specifieke promotor, treedt op in het hele weefsel, zodat zowel migreren neuroblasts en de omgeving zou kunnen worden beïnvloed. Zo juxtaposition van deze twee benaderingen kan bepalen of een bepaalde migratie gebrek is te wijten aan autonoom of cel non-autonome mechanismen cel. Defecte migratie in zowel experimentele systemen suggereert dat de waargenomen fenotype resultaten uit een cel autonoom mechanisme; normale migratie elektroporatie van Cre met defecte migratie in een weefsel-specifieke Cre model geeft aan dat het gen van interesse optreedt via een niet-cel-autonome mechanisme.

IUE kan ook worden gebruikt om de redding experimenten uit te voeren door electroporating potentiële interactie van genen in knock-out dieren ^7,9,10. Zo kan een onderzoeker proberen een migratie fenotype in een transgene model redden door electroporating een stroomafwaarts doel en het bepalen of de migratie defect gecorrigeerd in de geëlektroporeerd neuronen. Dit heeft het bijkomende voordeel dat een succesvolle rescue aan dat normale migratie kan worden hersteld door het manipuleren eiwitexpressie in een spefieke neuron, terwijl de omgeving nog deficiënt het doelgen. Nogmaals, deze benadering meer tijd en kosten effectiever dan kruisen of transgene lijnen met het extra voordeel van het bepalen of de defecte mechanisme cel autonoom.

IUE kan worden gebruikt voor het volgen migrerende neuronen door elektroporatie van een reporter plasmide in knockout embryo's (Figuur 4C). Aangezien alleen de neuronen langs het ventrikel op het moment van chirurgie geëlektroporeerd ¹⁷ kan IUE worden gebruikt om de neuronen geboren op een bepaald tijdstip met het voordeel van visualisatie van hun morfologie in vivo volgen.

Tenslotte is het mogelijk om IUE om hersengebieden richten zoals de mediale en dorsale telencephalon, hippocampus of ganglien verhevenheid (figuur 2). Dit geeft onderzoekers de bevoegdheid om genfunctie te onderzoeken in een bepaald gebied onafhankelijk van complicaties resultaating van proteïne knockdown in naburige structuren.

Retinoblastoomeiwit (pRb), p107 en p130 bestaat uit de zak eiwit familie en zijn goed ingeburgerd regulatoren van de celcyclus exit. Echter, er is steeds meer bewijs dat deze eiwitten celcyclus onafhankelijke aspecten van de ontwikkeling van het zenuwstelsel te reguleren ook. Zoals we eerder hebben laten zien, pRb en p107 spelen een cruciale rol in zowel de tangentiële ^4,23 en radiale migratie ^6. Hier tonen we de rol van pocket eiwit familieleden pRb en p107 op neurale migratie ⁶ het gebruik van in utero elektroporatie van Cre illustreren in een transgeen model. Samengevat, IUE biedt een krachtige manier van analyseren cel autonome effecten van gendeletie (of overexpressie). In combinatie met weefsel-specifieke knock-out modellen, kan IUE aanvullende informatie over de mechanismen die de neurale migratie bieden.