生物医学研究における牛の肺：視覚ガイド付き気管支鏡検査、気管支内接種および<em>インビボ</em>サンプリングテクニック

倫理に関する声明 本研究では、動物の管理と使用に関する欧州と国内法を遵守して実施した。プロトコルは、動物実験の倫理委員会とチューリンゲン州の動物の保護、​​ドイツ（：04-004/11許可番号）によって承認された。全ての実験は動物保護のために認可された機関のエージェントの監督の下で実施した。気管支鏡検査は厳密に全身麻酔下で行った。研究中に、あらゆる努力が不快感や苦痛を最小限にするために行われました。 総説 記載されている技術は、約60〜80 kgの、生後約6〜8週間の子牛のために開発されている。他の大型動物種や年齢や体重の異なる子牛に使用するためには、技術は大きさと重量にフィットし、考慮し、特定の動物種の肺解剖学的構造を取るために適合させなければならない。すべて使用した装置は、無菌でなければならない。 オウム病クラミジアは、ヒトでの呼吸器と一般的疾患を引き起こす可能性が人獣共通細菌である。非鳥類で現在のプロトコルで使用されるオウム病菌株 DC15は、バイオセーフティーレベル2の下で処理されなければならない。病原体や感染動物とのすべての作業は、人工呼吸器、スプラッシュウォータープルーフジャンプスーツ、長靴や手袋などの保護具を着用して行う必要があります。適切な保護マスクを身に着けていることは、非常に重要であるCの感染の自然経路からオウム病はのAerogenです。サンプルの包装及びラベルは、すべてのものは、動物の収容部を離れる前に、メーカーの指示に従って、クラミジアに対する効果的な消毒剤で処理しなければならないので、消毒証明である必要があります。 1。気管支鏡検査のための動物の準備麻酔薬の投与量のための子牛の重量を決定する。 静脈内（IV）アクセスiのを配置N左頸静脈。 まず、ゆっくりと鎮静が発生した後、（2.0 mg / kgの体重）ケタミンを注入、その後、約30秒間にわたって（0.2 mg / kgの体重）キシラジンを注入。 テーブルの上に動物を持ち上げ、右横臥に配置します。動物が適切にテーブルの上に配置されるとIVアクセスが所定の位置にまだあるかどうか確認し、必要に応じて再調整します。麻酔中、定期的に麻酔の深さを決定するために、まぶたの反射を確認してください。 動物が着実に呼吸していると、誰かが舌を抜くと首を伸ばす必要があります。わずかに回転運動を使用して、動物の口の中に金属管鏡を配置します。喉頭が表示されるまで、懐中電灯を使用して、視力の制御下に前進鏡を押してください。 必要に応じて、7 mgのキシラジンおよび70 mgのケタミンのボーラスを注入することによって、全体の内視鏡手術全体で麻酔を維持。 2接種（接種サイト：図1） </p> 1、2を含む接種材料との3注射器、および接種物の5ミリリットルを用意します。 内視鏡のワーキングチャンネルにテフロンチューブを挿入します。チューブは、内視鏡の先端から突出しないようにしてください。 金属鏡を通して内視鏡を挿入します。鏡のわずかな再調整は、喉頭の通過を可能にするために必要な場合があります。右側に分岐し、モニターに画像を位置合わせするために役立ちます気管支気管 、。 テフロンチューブの先端に5ミリリットル接種で注射器を取り付けます。接種物が堆積されなければならない枝にチューブを移動し、所望の量（右肺適用されます。 葉中殿 ：0.5ミリリットルを、 葉の補助器官 ：0.5ミリリットル、 葉は尾側 ：0.5ミリリットルと1.0ミリリットルを、左肺： 葉は、Parsでcranialをcranial ：0.5ミリリットル、Parsで尾 ：0.5ミリリットル、 葉は尾側 ：1.5ミリリットル）を。 1で注射器を取り付け＆＃160;チューブミリリットルの接種材料は、 気管支気管に移動し、（ 葉のcranial、Parsで尾 ：1.0ミリリットル）の接種材料を堆積させる。それは、常に同じ順序でローカライズにアプローチすることが有用である。 内視鏡と鏡を取り外します。 アクチュエータで各鼻孔に接種物の1ミリリットルスプレーします。 戻って安定したの動物を持参し、目を覚ますために発生しやすい位置に配置します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人または他の動物の会社で動物を放置しないでください。体温調節のための動物の能力は全身麻酔下で減少するため、回復、安定には、エアコンがなければならない。 注：最初の臨床症状は使わ病原体に応じて、接種後約24〜36時間後に発生する必要があります。 3サンプリング手順（サンプリングサイト：図2） ステップ1.1〜1.6で説明したように動物を準備します。 気管支肺胞洗浄水浴中で、滅菌等張食塩水20ミリリットルを含む5シリンジそれぞれを配置し、それらを約38℃まで昇温することができます内視鏡のワーキングチャンネルに洗浄カテーテルを挿入し、金属鏡内視鏡を挿入し、内視鏡は、さらに先のいずれかを押すことができない場合、「ウェッジ位置」に達するまで左肺の主気管支にナビゲートする。 相次いで、洗浄カテーテルに温かいNaCl溶液で注射器を取り付け、液体を浸透し、それを直接吸引除去する。気管支肺胞洗浄液は、シリコン処理ガラスびんに保存され、ガラス表面に付着する肺胞マクロファージを防ぐために、すぐに回復した後、氷上に置かれている必要があります。点滴の生理食塩水の量​​と、回収液量の両方に注意してください。 作業チャネルから洗浄カテーテルを取り外します。 気管支ブラッシング記述されたプロトコルで、これは気管分岐部で、所望のサンプリングの場所に内視鏡を移動します。 ブラシの先端がモニターに表示されるまで、内視鏡の作業チャネルに挿入する前に、チューブブラシをカバーしています。 ブラッシングする場所にナビゲートして、ハンドルを押して、約5cm前進プラスチックチューブブラシを押して、プラスチック管からそれを明らかにします。 ブラシと気管支の壁との間の接触を確実にするために、内視鏡をナビゲートしながら、ゆっくりと前後​​にブラシを押し引きすることによって上皮の呼び出しをこすり。出血が発生したときにこすり停止します。作業チャネルから引き出し前にチューブブラシをカバーしています。 そっとスライド上でブラシを転がすことによって顕微鏡スライド上の5スメアまで準備します。 -20℃で10分、空気乾燥して保存するための冷メタノール中でスミアを固定ブラシでリンスすることができますサンプリングされたセルの目的に応じて種々の媒体。同じブラシで複数のブラッシングを取った場合、唯一の粘膜を刺激しないメディアでそれを洗い流してください。 経気管支的肺生検記述されたプロトコルで、これは葉のcranialの扁平部尾で、所望のサンプリングの場所に内視鏡を移動します。作業チャネルのオープンに生検鉗子を挿入する前に、それがスムーズに動作することを確認し、それを数回を閉じる。 若干の抵抗が発生するまで気管気管支の尾ブランチに生検鉗子を押してください。 、鉗子を開い前進約2cmを押し、鉗子を閉じて、引き戻すと作業チャネルから鉗子を外し、バック2〜3センチメートルを引っ張る。これはいくつかの練習が必要です。 慎重に針や小さなピンセットを用いて、生検鉗子から組織を除去する。組織のさらなる用途に応じて、液体nitrに保管プラスミン又は適切な固定媒体。これは自己分解プロセスを防止するために除去した後に権利が起こるはずです。 術後の治療戻って安定したの動物を持参し、目を覚ますために発生しやすい位置に配置します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人または他の動物の会社で動物を放置しないでください。体温調節のための動物の能力は全身麻酔下で減少するため、回復、安定には、エアコンがなければならない。 次の24時間、気胸の兆候が密接に動物を監視します。動物が完全な意識を取り戻したとき、フィード、新鮮な水を提供しています。