JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

ברונכוסקופיה מודרכת מבחינה ויזואלית, Intrabronchial הרכבת חיסון ו: ריאות שור במחקר ביו<em> בVivo</em> טכניקות דגימה

Published: July 03, 2014
doi:
10.3791/51557
, , ,
1Institute of Molecular Pathogenesis,Friedrich-Loeffler-Institut

Summary

מאמר זה מתאר טכניקות bronchoscopic בריאת השור תחת תנאי ניסוי, כלומר חיסון מודרך bronchoscopically, שטיפה ברונכואלוואולרית, צחצוח הסימפונות, וביופסית ריאות transbronchial.

Abstract

יש חיפוש מתמשך למודלים של בעלי חיים אלטרנטיביים במחקר של רפואה בדרכי הנשימה. בהתאם למטרה של המחקר, בעלי חיים גדולים כמודלים של מחלת ריאות לעתים קרובות דומים למצב של אדם הריאות הרבה יותר טוב מאשר עכברים לעשות. עבודה עם בעלי חיים גדולים גם מציעה את ההזדמנות לטעום אותו בבעלי החיים שוב ושוב על קורס מסוים של זמן, המאפשר מחקרים ארוך טווח, מבלי להקריב את בעלי החיים.

המטרה הייתה להקים בvivo שיטות דגימה לשימוש במודל שור של זיהום psittaci כלמידיה בדרכי הנשימה. דגימה צריכה להתבצע בנקודות זמן שונות בכל בעל חיים במהלך תקופת המחקר, והדגימות צריכה להיות מתאימות כדי ללמוד את התגובה המארחת, כמו גם את הפתוגן בתנאי ניסוי.

ברונכוסקופיה היא כלי אבחון חשוב ברפואת אדם ולשימוש וטרינרים. זהו הליך בטוח ופולשנית. ארטיק זהle מתאר את חיסון intrabronchial של עגלים, כמו גם שיטות דגימה לדרך הנשימה התחתונה. Videoendoscopic, חיסון intrabronchial מוביל לממצאים קליניים ופתולוגי מאוד עקביים בכל בעלי החיים מחוסן, והוא, אם כן, מתאים היטב לשימוש במודלים של מחלת ריאות זיהומית. שיטות הדגימה המתוארות הן שטיפה ברונכואלוואולרית, צחצוח הסימפונות וביופסית ריאות transbronchial. כל אלה הם כלי אבחון חשובים ברפואה אנושית ויכול להיות מותאם למטרות ניסיוניות לעגלים בגילי 6-8 שבועות. הדגימות שהתקבלו היו מתאימות גם לזיהוי הפתוגן ואפיון של החומרה של דלקת ריאות במארח.

Introduction

הערכים של מודלים בבעלי חיים גדולים במחקר ביו

במחקר ביו תחומי מודרני, מודלים של בעלי החיים הם עדיין הכרחיים כדי להבהיר אינטראקציות מורכבות – הקשורים לבריאות או מצב מחלה – בתוך אורגניזמים יונקים. למרות 17 פרסי הנובל שהוענק למדענים שחקרו בקר, סוסים, כבשים, או עופות כמודלים למחקר ביו 1, כיום רובם המכריע של ניסויים בבעלי החיים מתבצעים עם מכרסמים, בעוד שפחות מ 1% מהמחקרים עובדים עם חיות בית או בעלי חיים.

בעלי חיים קטנים מציעים הרבה יתרונות מעשיים (כלומר בעלות נמוכה, גמישות גנטית, תפוקה גבוהה, זמינות של מספר רב של גנטי, וכלים וערכות חיסוניים), ומודלים עכבריים מהונדסים גנטי הם מקובלים לבצע מחקרים מכניסטית לגלות מסלולים מולקולריים מסוימים. במחקר ביו של מערכות, לא מורכביםהוא רלוונטי ביולוגי ותועלת קלינית של מודלים בעכברים הופכים יותר ויותר בספק. הם יכולים להיות מטעים ולשאת בסיכון של פשטנות של מורכבות ביולוגיות 2-9.

בשל ייחוד בין מינים, לא בעלי חיים יחיד יהיו במראה לחלוטין את המצב האנושי, ונראה את השימוש במודל אחד או יותר כדי להיות מועיל בגישת מחקר ביו בינתחומי. בהקשר של רפואת translational, בעלי חיים גדולים מציעים את ההזדמנות לשרת את המודלים השוואתיים כלספק תוצאות עם שייכות ביולוגית גבוהה של שימוש כפול עבור שני בני אדם וחיות בריאות 1. למרבה הפלא, את הגנום האנושי הוא דומה באופן הדוק יותר על ידי הגנום השור מאשר על ידי הגנום של מכרסמים מעבדה. כמו כן, אושר לאחרונה כי, בהשוואה למינים אחרים, הגנום של עכברים הוא הרבה יותר מחדש 10-12.

במערך מחקר מורכב, שימוש בבעלי החיים מציעים uniqהזדמנות UE של מחקרים על ידי איסוף חוזר ונשנה של מגוון רחב של דגימות in vivo מהאחד ו- אותו individuum מבלי להקריב בעלי החיים התוך בודדים, לטווח ארוך. לכן, ניתן לנטר שינויים פונקציונליים, דלקתיים ומורפולוגיים באותו הנושא על פני תקופה מסוימת של זמן 13.

ריאות שור כמודל נשימה מתאים

בשל המספר הגבוה של הבדלים משמעותיים באנטומיה ריאות, פיזיולוגיה נשימה, ואימונולוגיה ריאות, עכברים לא מתרבים היבטים רבים pathophysiological חשובות של מחלת ריאות אנושית. זה חייב להילקח בחשבון בעת שימוש בהם כמודלים של בעלי חיים למחלות בדרכי הנשימה 2,9,14-16. למרות מוזרויות של האנטומיה ומבנה קיימות עבור כל ריאות של יונקים, מאפיינים פונקציונליים (כרכי ריאות כלומר, זרמי אוויר ומכניקת נשימה) הם טובים יותר להשוואה בין בני אדם בוגרים ועגלים בשל משקלי גוף דומים(50-100 קילוגרם).

מאפייני המינים ספציפיים של הריאה השור הם כדלהלן: הריאה השמאלית מורכבת משתי אונות (cranialis lobus, אשר מחולקת לשני חלקים, וcaudalis lobus), בעוד שהריאה הימנית מורכבת מארבע אונות (lobus cranialis, lobus medius, caudalis lobus, וaccessorius lobus). בניגוד לאנטומיה הריאות של רוב יונקים אחרים, הסמפונות של הסניפים תקין גולגולת אונה ישירות מהצד לרוחב ימין של קנה הנשימה. עם כל כבוד לsubgross אנטומיה, ריאות השור מציגה רמה גבוהה של lobulation ואחוז גבוה של רקמת ביניים 17,18 המוביל לעמידת ריאות ספציפית נמוכה יחסית והתנגדות רקמות pulmonic גבוהה 19. לכן, פעילות הנשימה הנדרשת היא גבוהה למדי בהשוואה למינים אחרים 20,21. הרמה הגבוהה של lobulation מובילה לעצמאות חזקה מהמגזרים. לפיכך, infתהליכי lammatory הם מוגבלים על ידי septa רקמת חיבור, ומגזרים חולים ובריאים לעתים קרובות נמצאים בתוך אותה האונה. בשל המחסור בדרכי נשימה בטחונות, ריאות שור הוא מתאים במיוחד למראה תפקוד ריאות חסימתית 13. באשר לכלי הדם של ריאת השור, עורקי ריאה הקטנים מראים שכבות שריר חלק בולטות מאוד. לכן, השוקיים עשויים גם לשמש כמודל בבעלי חיים מבוסס של יתר לחץ דם או בכלי דם הריאתיים שיפוץ 22-24.

עם כל כבוד לזיהומים בדרכי הנשימה, מחלות באופן טבעי קיימות בבעלי חיים שחולקות קווי דמיון רבים עם המחלה הדומה באדם. דוגמאות אופייניות הן שחפת שור 25, וירוס סינסיציאלי נשימה זיהומים (RSV) בשוק 26-28, או זיהומי כלמידיה שנרכשו באופן טבעי 29. לפיכך, מודלים של בעלי חיים גדולים שמקרוב דומים למצב במארח הטבעי. לכן, הם רוב useful לחקר אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן והפתופיזיולוגיה המורכבת של המחלה המקבילה בבני אדם 30,31.

כמודל רלוונטי מבחינה ביולוגית של זיהום psittaci כלמידיה בדרכי הנשימה, שוקיים נבחרו מאז ראשי בקר מייצגים פונדקאים טבעיים לפתוגן זה 32-35. מידע המתקבל ממודל זה, ביחס לפתוגנזה של המחלה או נתיבי הולכה אפשריים בין בעלי חיים ובני האדם, יסייע להרחיב את הידע שלנו עם השפעה לשתי בהמות ואדם. המודל גם יכול לעזור כדי לוודא אפשרויות טיפוליות חלופיות מקובלות ולחיסולה של ג ריאתי זיהומי psittaci, שהוא, שוב, עניין בשתי רפואת הווטרינרית ואנושית.

טכניקות יישומים ולדוגמאות אפשר להשיג ממערכת הנשימה שור

מאמר זה מתאר וממחיש את הטכניקות ושיטות אבחון applicablדואר לריאות שור והשתמש במודל שלנו להערכה גם את ההשפעות של הפתוגן על הריאות של יונקים ואת היעילות של התערבות טיפולית.

ברונכוסקופיה שבוצעה ברפואה אנושית מאז 1960s, והוא נחשב הליך בטוח 36. בשוק, ברונכוסקופיה הניסיונית תוארה ב -1968 בפעם הראשונה 37. יישום intrabronchial של פתוגנים הוצע על ידי Potgieter et al. כשיטת אמינה כדי לייצר מחלה בדרכי נשימה תחתונה בשוק 38 וכיום היא שיטה נפוצה במחקר שור 34,39,40. חיסון Intrabronchial של כמות מוגדרת של הפתוגן תחת שליטת videoendoscopic מאפשר להשמה סלקטיבית של הגורם המזהם בריאות. זה מוביל לממצאים קליניים ופתולוגיים עקביים בכל בעלי החיים 34 ומאפשר דגימה ממוקדת של אזורי ריאה אשר צפויים להשתנות כתוצאה מחשיפת הפתוגן.

<pclass = "jove_content"> נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (בלף) הוא אינדיקטור שתואר היטב לנוכחות והחומרה של דלקת ריאות. שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) היא הליך סטנדרטי ברפואה אנושית לאבחון של מגוון רחב של מחלות בדרכי הנשימה 41. בבקר חי, BAL הוצג על ידי ווילקי ומרקם בסוף שנות השבעים של המאה שעברה 42. זה נחשב טכניקה בטוחה ודיר כדי ללמוד את דרכי נשימה התחתונות של הבקר. בשל היעדר נתונים מספקים על הפרמטרים בלף בבעלי חיים בריאים, בשינה 1988 BAL ביצע פרינגל et al. על עגלים בריאים עם bronchoscope סיב אופטי גמיש. המחברים גם הצביעו על הצורך לתקנן פרוטוקולי BAL תחת תנאי ניסויים לרכוש תוצאות דומות 43. BAL עדיין משמש כשיטת דגימת in vivo בשוק 44-46.

צחצוח הסימפונות משמש ברפואה אנושית בכינויוכלי אבחון כדי לדגום נגעי neoplastic או לניתוח מיקרוביולוגית 36. למטרות מחקר, ניתן להשיג בתרביות תאים ראשוניות של תאי האפיתל שנקטפו על ידי צחצוח ציטולוגית 47. בבקר, השימוש בbrushings הסימפונות לניתוח מיקרוביולוגית תואר לאפיין את סביבת החיידקים של הריאות 43.

ביופסיה הריאה Transbronchial מספקת דגימות רקמת ריאה והוא כלי אבחון בעל ערך עבור מפוזר מחלות ריאה בבני אדם. pneumothorax אבחנה רפואי ודימום הקשורים בהליך הם סיבוכים הקשורים לטכניקה זו. השכיחות שלהם היא דיווחה להיות פחות מאחוז אחד בחולים אנושיים 48. הביופסיה הריאה Transbronchial היא לא שיטה נפוצה לשימוש בבקר, בשל העלות הגבוהה של הציוד הנדרש והזמן הדרוש כדי להשיג ביופסיות. במקום זאת, ביופסיות הריאה transcutaneous יותר נוחים בתנאי שדה 49-51.

Protocol

הצהרת אתיקה מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם חוק אירופאי והלאומי לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים וההגנה על בעלי חיים במדינת תורינגיה, גרמניה (מספר אישור: 04-004/11). כל הניסויים בוצעו תחת פיקוח של הסוכן המוסדי המורשים להגנה על בעלי החיים. ברונכוסקופיה בוצעה אך ורק תחת הרדמה כללית. במהלך המחקר, נעשה כל מאמץ על מנת למזער אי נוחות או סבל. הערות כלליות הטכניקות המתוארות פותחו עבור השוקיים של כ 6-8 שבועות של גיל, במשקל של כ 60-80 קילוגרם. לשימוש במינים אחרים של בעלי חיים גדולים או השוקיים שונים בגיל ובמשקל גוף, הטכניקות צריכה להיות מותאמות כך שיתאימו לגודל ומשקל ולקחת בחשבון את האנטומיה הריאות של מיני בעלי חיים המסוים. כלציוד המשמש חייב להיות סטרילי. psittaci כלמידיה הוא חיידק zoonotic אשר עלול לגרום למחלות בדרכי הנשימה ובכלל בבני אדם. ג שאינו העופות זן psittaci DC15 שימוש בפרוטוקול הנוכחי יש לטפל בם במסגרת בטיחות ביולוגית ברמה 2. כל העבודה עם הפתוגן ועם בעלי חיים נגועים חייבת להתבצע לובשת ציוד מגן אישי, כגון מכונת נשמה, סרבל הוכחת מים סנסציה, מגפי גומי וכפפות. לובש הנשמה מתאימה הוא בעלת חשיבות רבה, שכן התוואי הטבעי של זיהום לג psittaci הוא aerogen. אריזה וסימון של דגימות חייבת להיות הוכחת חיטוי מאז יש להתייחס אל כל הדברים בחומר חיטוי יעיל נגד chlamydiae על פי הוראות היצרן לפני שעזב את יחידת הדיור של בעלי החיים. 1. הכנת בעלי החיים לרונכוסקופיה לקבוע את משקליו של העגל למינון של חומרי הרדמה. הנח (IV) גישה לורידn וריד הצוואר השמאלי. ראשית, להזריק לאט xylazine (0.2 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) על פני כ 30 שניות, ולאחר מכן, לאחר הרגעה מתרחשת, להזריק קטמין (2.0 מ"ג / קילוגרם משקל גוף). הרם את בעלי החיים על השולחן ומניח אותו בכיבה לרוחב נכון. לאחר החיה ממוקמת כראוי על השולחן, לבדוק אם גישת IV היא עדיין במקום ולתקן אותו במידת צורך. במהלך הרדמה, לבדוק באופן קבוע את רפלקס העפעף כדי לקבוע את עומק ההרדמה. ברגע שבעל החיים הוא נושמים בקצב קבוע, שיש מישהו למשוך את הלשון החוצה ולמתוח את הצוואר. מניחים ספקולום צינור מתכת בפיו של בעל החיים, תוך שימוש בתנועות סיבוב קלות. דחוף את ספקולום קדימה תחת שליטת ראייה, תוך שימוש בפנס, עד שהגרון הוא גלוי לעין. לשמור על הרדמה לאורך כל הליך אנדוסקופי על ידי הזרקת בולוס של 7 xylazine מ"ג ו70 קטמין מ"ג לפי צורך. . 2 חיסון (חיסון אתרים: איור 1) </p> הכן 3 מזרקים עם הבידוד, המכילים 1, 2, ו 5 מיליליטר של הבידוד. הכנס צינור טפלון לערוץ החוזר של אנדוסקופ. הצינור לא צריך לבלוט מהקצה של אנדוסקופ. הכנס את אנדוסקופ דרך ספקולום המתכת. readjustments הקל של ספקולום עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר לפטירתו של הגרון. Trachealis הסמפונות, שמתפצל לצד ימין, עוזר ליישר את התמונה על המסך. צרף את המזרק עם הבידוד 5 מיליליטר לקצה צינורית הטפלון. נווט בצינור לסניפים שבי הבידוד יופקד ולהחיל את הכמות הרצויה (ריאה ימנית: medius Lobus: 0.5 מיליליטר, accessorius Lobus: 0.5 מיליליטר, Lobus caudalis: 0.5 מיליליטר ו1.0 מיליליטר; שמאל ריאות: cranialis Lobus, Pars cranialis : 0.5 מיליליטר, Pars caudalis: 0.5 מיליליטר, Lobus caudalis: 1.5 מיליליטר). צרף את המזרק עם 1 &# 160; מיליליטר הבידוד לצינור, ואז לנווט לtrachealis הסמפונות ולהפקיד את הבידוד (cranialis Lobus, Pars caudalis: 1.0 מיליליטר). זה מועיל תמיד להתקרב מגויר באותו סדר. הסר את אנדוסקופ וספקולום. ספריי 1 מיליליטר של הבידוד לכל נחיר עם מפעיל. להביא את בעלי החיים בחזרה לאורווה ולמקם אותו בעמדה נוטה להתעוררות. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה או בחברתם של בעלי חיים אחרים עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה. יציב ההתאוששות צריך להיות ממוזג, שכן יכולתו של בעל החיים לויסות חום היא ירד בהרדמה כללית. הערה: סימנים קליניים ראשונים אמורים להתרחש על 24-36 שעות לאחר חיסון, בהתאם לפתוגן בשימוש. . 3 נהלי דגימה (Sampling אתרים: איור 2) הכן את בעלי החיים כפי שמתואר ב1.1-1.6 צעדים. ברונכואלוואולרית שטיפה מקום 5 מזרקים בכל המכילים 20 מיליליטר של תמיסת מלח איזוטונית סטרילית, במי אמבטיה ולאפשר להם לחמם עד כ 38 ° C. הכנס קטטר שטיפה לערוץ החוזר של אנדוסקופ, ולאחר מכן להכניס את אנדוסקופ לתוך ספקולום המתכת ולנווט קדימה לתוך הסמפונות העיקרית של הריאה השמאלית עד שתגיע "עמדת הטריז" שבו אנדוסקופ לא יכול להיות דחף כל עוד לפנינו. בזה אחר זה, לצרף את המזרקים עם פתרון NaCl החם לשטיפת קטטר, להחדיר את הנוזל ולשאוב אותו ישירות. נוזל שטיפת רונכואלוואולרית חייב להיות מאוחסן בבקבוקי זכוכית siliconized ולשים על קרח מייד לאחר התאוששות כדי למנוע מקרופאגים מכתשיים מהצמדה למשטח הזכוכית. שים לב גם את הכמות של תמיסת מלח והחדיר את כמות הנוזלים התאוששו. הסר את צנתר שטיפה מהערוץ עובד. צחצוח הסימפונות נווט באנדוסקופ למיקום הדגימה הרצוי, בפרוטוקול המתואר זה tracheae Bifurcatio. כסה את המברשת עם הצינור לפני הכנסתו לערוץ החוזר של אנדוסקופ עד הקצה של המברשת מופיע על הצג. לדחוף את המברשת עם צינור הפלסטיק קדימה כ -5 ס"מ ולחשוף אותו מצינור הפלסטיק על ידי לחיצה על הידית, ואז לנווט אותו למיקום שהוא להיות מוברש. תדבק שיחות אפיתל בעדינות על ידי דוחף ומושך את המברשת קדימה ואחורה בזמן ניווט אנדוסקופ כדי להבטיח מגע בין המברשת והקיר של הסמפונות. תפסיק לשפשף כאשר מתרחש דימום. כסה את המברשת עם הצינור לפני תלישה של הערוץ עובד בו. הכן עד חמישה כתמים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי בעדינות מגלגל את המברשת על השקופית. לקבע את המריחות במתנול הקר עבור 10 דקות, אוויר יבש ולאחסן ב -20 ° C. המברשת ניתן לשטוף באמצעי תקשורת שונים, בהתאם לצורך של תאי שנדגמו. אם לוקח brushings מרובה עם אותה המברשת, הקפד לשטוף אותו רק בתקשורת שאינו מגרה את הרירית. ביופסיה הריאה Transbronchial נווט באנדוסקופ למיקום הדגימה הרצוי, בפרוטוקול המתואר זה caudalis Pars של cranialis Lobus. לפני החדרת המלקחיים הביופסיה לתוך תעלת העבודה פתוחה ולסגור אותו כמה פעמים כדי לוודא שהוא עובד בצורה חלקה. דחוף את המלקחיים ביופסיה לסניף הזנב של הסמפונות trachealis עד התנגדות קלה מתרחשת. משוך לאחור 2-3 סנטימטר, פתח את המלקחיים, לדחוף קדימה על 2 סנטימטר, לסגור את המלקחיים, למשוך בחזרה והסר את המלקחיים מהערוץ עובד. זה דורש קצת תרגול. מוציא בזהירות את הרקמה מביופסית המלקחיים, תוך שימוש במחט או מלקחיים קטנים. בהתאם לשימוש נוסף של הרקמות, לאחסן אותו בnitr הנוזליעוגן או בינוני קיבוע מתאים. זה צריך לקרות מייד אחרי ההסרה כדי למנוע תהליכי autolytic. טיפול שלאחר פרוצדורליים להביא את בעלי החיים בחזרה לאורווה ולמקם אותו בעמדה נוטה להתעוררות. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה או בחברתם של בעלי חיים אחרים עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה. יציב ההתאוששות צריך להיות ממוזג, שכן יכולתו של בעל החיים לויסות חום היא ירד בהרדמה כללית. לפקח על בעלי החיים מקרוב אחר סימנים של חזה אוויר לשעה 24 הבאה. לספק מזון ומים טריים, כאשר בעל החיים חזרו להכרה מלאה.

Representative Results

מהלך המחלה ההשפעה של הפתוגן על בריאותם של בעלי החיים ניתן להעריך על ידי בדיקה קלינית. במודלים של הזיהום בדרכי הנשימה שלנו, בעלי חיים נבדקו פעמיים ביום ותצפיות קליניות נרשמו באמצעות שיטת ניקוד. מידע נוסף נכבש על ידי ביצוע in vivo שיטות אחרות דגימה, למשל, אוסף של דם ומטליות או מדידת תפקוד ריאות. בדיקות פתולוגיות בוצעו בנקודות זמן שונות לאחר חיסון כדי לתאר את ההתקדמות של הזיהום 32-34. בלף שיעור ההחלמה קצב ההתאוששות של הנוזל החדיר היה 83.05 ± 4.58% (ממוצע ± סטיית תקן). איתור פתוגן Recultivation של הפתוגן יכול להתבצע מbrushings הסימפונות. כמו כן, הקרנת PCR של דגימות שונות אפשר לזהות את הפתוגן, למשל tiביופסיה ssue, מדגם מברשת ציטולוגיה, בלף-תאים 52 או ספוגית בלוע. ויזואליזציה של פתוגן אפשרית על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה סעיפים קפוא של ביופסיות הריאה והכנות שקיעה של בלף-התאים (איור 3). בניסויים קודמים, ה-PCR של דגימות דם ודגימות (הלחמית, צואה, אף) בוצעה כדי לאפיין את ההתפשטות ושפיכה של הפתוגן 32. סמנים של דלקת המקומית של רקמת הריאה בבלף, פרמטרים שונים של דלקת ריאות ניתן ללמוד. ספירת התאים בסך הכל, ואת חלקם של הנויטרופילים בדרך כלל להגדיל כאשר דלקת ריאות היא הווה. להתמיינות תאים, יכולות להיות מוכתמות הכנות שקיעה של בלף-תאים פי Giemsa ומובחן באמצעות טבילת שמן (איור 4). פרופורציות נייד ונוזליות של בלף מופרדות על ידי צנטריפוגה (XG 300; 20 דקות). בלף-Supernatant מכיל סמנים שונים המשתנים במהלך תהליכים דלקתיים בריאה וניתן ללמוד תחת תנאי ניסוי. דוגמאות לכך הן חלבון וeicosanoids 29,34 סך הכל. סקירה סכמטית של שימוש נוסף האפשרי של הדגימות תיארו מוצגת באיור 5. איור 1. תכנית של הריאה השור עם אתרי חיסון (צהוב). המספרים מציינים את הסדר שבו הבידוד מנוהל לתוך הסמפונות שונה. R: ימין; L: עזב. ריאה ימנית: medius Lobus 1: 0.5 מיליליטר, 2 accessorius Lobus: 0.5 מיליליטר, 3 caudalis Lobus: 0.5 מיליליטר ו -4 1.0 מיליליטר; ריאה שמאלית: cranialis Lobus, <strong> 5 Pars cranialis: 0.5 מיליליטר, caudalis 6 Pars: 0.5 מיליליטר, 7 caudalis Lobus: 1.5 מיליליטר, 8 cranialis Lobus, Pars caudalis: 1.0 מיליליטר. . איור 2 תכנית של הריאה השור עם אתרי חיסון (צהוב) ואתרי דגימה:. שטיפה ברונכואלוואולרית (כחולה), צחצוח הסימפונות (ירוקה), וביופסית ריאה (כתום) שים לב כי כל הדגימות שהתקבלו מאזורים שבם הפתוגן הופקד לפני. R: ימין, L: עזב. איור 3.) ביופסיה ריאות מעגל מחוסן עם Chl psittaci amydia 4 ימים לאחר החיסון (dpi), ב) משקעים סלולריים של בלף מעגל מחוסן עם ג dpi psittaci 9. תיוג immunohistochemical לchlamydiae. תכלילים כלמידיה (חיצים) נמצאים הריאה (א) ובמקרופאגים מכתשיים (ב). counterstain hematoxylin. איור 4. משקעים נייד של בלף מעגל מחוסן עם ג מקרופאגים psittaci 9 dpi. מכתשיים (#) הם סוג התא הדומיננטי בבלף. הסכום של גרנולוציטים נויטרופילים (*) עולה כאשר תהליכים דלקתיים הם הווה. מכתים פפנהיים השתנה. "Width =" es.jpg 600 "/> איור 5. שיטות אפשריות להכנת מדגם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

שיטת bronchoscopic של חיסון שפותחה ושיטות דגימת bronchoscopic שונות הותאמו לשימוש בבעלי חיים גדולים בתנאי ניסוי. הטכניקות המתוארות הן קלים ללימוד, אפילו עבור בוחנים עם ניסיון מועט באנדוסקופיה. התהליך של ברונכוסקופיה הוא פולשנית וללא תופעות לוואי הקשורות בשיטות של החיסון, כמו גם את שיטות הדגימה תיארו (BAL, ביופסיה של הריאה transbronchial, צחצוח הסימפונות), שראו אי פעם בכל אחד מבעלי החיים. הסיבוכים הקשורים בביופסיות ריאה transbronchial בבני האדם מדממים וחזה האוויר 48, כל אלה לא נראו בשוק שעברו הליך זה. הביופסיה הריאה transbronchial היא זמן רב יותר ודורשת יותר ציוד מאשר בשיטת transcutaneous, אבל זה פחות פולשני ואינו נושא בסיכון לזיהום פצע.

, השיטה אנדוסקופית חזותי המבוקר של inoculatיון מאפשר התצהיר של כמות מוגדרת של הפתוגן באתרים ספציפיים של הריאות. לפיכך, תוצאה הוא ממצאים קליניים ופתולוגי מאוד עקביים בכל בעלי החיים מחוסן 32-34. עם זאת, זה לא דומה לכל התכונות של זיהום טבעי בשוק. במודל של ג נשימה זיהום psittaci, הטכניקה המתוארת של חיסון הוביל לנגעי ריאות הקשורים לאתרים של מיקום הפתוגן 34, ואילו, בעגלי זיהומים שנרכשו באופן טבעי בדרך כלל לפתח דלקת ריאות של אונות הפסגה. עובדה זו צריכה להילקח בחשבון כאשר לפרש את הרלוונטיות של ממצאי ניסוי בהקשר של דלקות ריאות נרכשות טבעיות בראשי בקר.

Videoendoscopic BAL מאפשר דגימת אזור מוגדר של הריאות. לצורך ניסויים, זה יתרון בהשוואה לשימוש בקטטר באף בתנאים עיוורים. בשל האנטומיה של ריאות שור, שהצנתר בצורה עיוורת יהיה דחיפהאד לאונה סרעפתית הנכונה ברוב המקרים 53,54 והבוחן אין לו השפעה על האזור של הריאות כי הוא lavaged. יתרון נוסף של BAL אנדוסקופית בשוק הרדים שכיבו לרוחב הוא שיעור ההחלמה הממוצע הגבוה של נוזל החדיר של יותר מ 80%. השוואה עם מחקרים אחרים מגלה כי, בעמידה, עגלים מסוממים, התאוששות של 133.3 ± 1.6 מיליליטר 46 ו127.13 ± 3.53 מיליליטר 45 לאחר החדרה של 240 מיליליטר נוזל לתוך האונה הזנב הוא מדווחת. בעגלים מסוממים בעינת חזה 51% מהנוזל החדיר יכולים להיות התאוששו מהאונה הגולגולת ו62% מהאונה הזנב 43. משמעות דבר היא כי כמחצית מהנוזל החדיר יכולה להיות התאוששה בתנוחה זקופה של העגל. בהתאם לכמות של בלף הדרוש להכנת מדגם נוספת, זה לא יכול להשאיר מספיק חומר כדי לבצע את כל הניסויים הרצויים. BAL בבקר כבר בשימוש על ידי קבוצות מחקר רבות ורביםפרמטרים שונים שנבדקו בתנאים שונים. רוב המחברים ביצעו שטיפה של אונות בסיס 43,45,46, אבל את כמות הנוזלים המשמשים לשטיפה שונה בין קבוצות המחקר. זה מוביל לחוסר עקביות בדילול של התאים התאוששו, חלבונים וחומרים אחרים, ולכן קשה להשוות את הממצאים מפרסומים שונים. לכן, לשימוש בבקר מומלץ שטיפה עם חמישה שברים של 20 מיליליטר (כלומר 100 מיליליטר בסך הכל) מי מלח חם, איזוטוני גוף, שהם התאוששו מייד לאחר החדרה. בעת שימוש בקטטר שטיפה עם קוטר גדול (כלומר> 2 מ"מ), הנפח של כל חלק צריך להיות גדל במעט, תלוי בכמות הנוזלים שתישאר בקטטר.

האנטומיה מפולחות מאוד של ריאות השור מובילה להגבלה שיטתית; תוצאות שהתקבלו מחלק אחד של הריאה לא יכולות להיות נכונות גם לגבי שאר הריאות. מאחר ואיןשליטת מראה של אזור הריאה כולה נחקר על ידי ביופסיה ושטיפה transbronchial, הבוחן לא יכול לדעת אם האזורים שנדגמו היו בריאים או חולים. לכן, זה מאוד חשוב למקומות בהם הפתוגן היה מחוסן לפני על מנת שיהיה קצב התאוששות גבוה יותר של הפתוגן ויש אפשרות גבוהה יותר של דגימת אזורי ריאה פגועות לטעום. מגבלה נוספת היא הסיכון המוגבר הרדמה בבעלי חיים של מצב קליני ירוד. יש להשתמש בשיטות שתוארו רק בדגמים של קל עד בינוניים למחלה לשמור את הנטל לבעלי החיים נמוכים ככל האפשר. הרדמה כללית במעלי גירה תמיד צריכה להיות כל הזמן קצר ככל האפשר, כמו פיתוח הגז בכרס הפנימי מגדיל את הסיכון בהרדמת מינים אלה. בעלי חיים חייבים להיות ממוקמים בעמדה נוטה מייד לאחר ברונכוסקופיה, כדי לאפשר הזרימה של הגז שפותח וחייבים להיות במעקב צמוד עד שהתאוששו לגמרי מהרדמה. כמו כן, הטכניקות המתוארות אינן suitable לדגימה במרווחים של פחות מ 24 שעות.

הפרוטוקול המתואר יכול להיות מותאם לחומרים מזהמים אחרים. חיסון אנדוסקופי של פתוגנים שונים תואר, כגון ג psittaci 32-34, haemolytica Pasteurella 38-40,42, somni Haemophilus 55, ווירוס שלשולים נגיפי שור 44. כמו כן, האתרים של הפקדת פתוגן בריאה יכולים להיות מותאמים למודל הרצוי. כשאתה בוחר את אתרי דגימה, כמה עובדות חשובות צריכים להילקח בחשבון: יש לבחור באתרים (i) דגימה המבוססים על מיקומם של חיסון ועל הממצאים פתולוגיים הצפויים. (Ii) כאשר נתיחה לאחר מוות הוא שיש לבצע יש להקפיד להשאיר את אזורי הריאה unsampled מספיק עבור vivo לשעבר דגימה. (Iii) יש לבחור מקומות באתר דגימה כך שניתן יהיה להגיע עם הציוד. במיוחד לביופסית ריאות transbronchial, יש מגבלות בשל אורכו של מלקחיים ביופסיה. (Iv) Tהוא בסדר גודל של דגימה הוא צחצוח חשוב, הסימפונות וביופסית ריאות transbronchial עלול להוביל לדימום קל, אשר היו לזהם את בלף. לכן, חייב להיות תמיד מתקבל בלף ראשון. בעת השימוש בפרוטוקול במינים אחרים, האנטומיה ריאות המינים ספציפיים חייבת להילקח בחשבון.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors are very thankful to the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) of Germany for the funding of their work. Also, the authors thank Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel and all the other colleagues working in the team of the animal house (FLI, Germany) for their technical assistance with the bronchoscopies. They are very thankful to Maria-Christina Haase (FLI, Germany) for her help in providing literature. Furthermore, the authors wish to express their gratitude to Dr. Angela Berndt (FLI, Germany) and Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) for critical reading of the manuscript.

Materials

Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2,2 mm, working length 140 cm
lavage catheter  Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
acuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10  working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess  Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter 1.2 mm, length 43 mm
Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
metal tube speculum  n/a n/a diameter: 3.5 cm, length: 35 cm
flashlight n/a n/a
siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
inoculum n/a dilute pathogen in 8mL buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ireland, J. J., Roberts, R. M., Palmer, G. H., Bauman, D. E., Bazer, F. W. A commentary on domestic animals as dual-purpose models that benefit agricultural and biomedical research. Journal of animal science. 86, 2797-2805 (2008).
  2. Persson, C. G. Con: mice are not a good model of human airway disease. American journal of respiratory and critical care medicine. 166, 6-7 (2002).
  3. Haley, P. J. Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology. 188, 49-71 (2003).
  4. Hein, W. R., Griebel, P. J. A road less travelled: large animal models in immunological research. Nature reviews. Immunology. 3, 79-84 (2003).
  5. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  6. Elferink, R. O., Beuers, U. Are pigs more human than mice. Journal of hepatology. 50, 838-841 (2009).
  7. Jawien, J., Korbut, R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. 61, 647-650 (2010).
  8. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3507-3512 (2013).
  9. Pabst, R. . Allergy and Allergic Diseases. 1, (2009).
  10. Bovine Genome, S., et al. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science. 324, 522-528 (2009).
  11. Tellam, R. L., et al. Unlocking the bovine genome. BMC genomics. 10, 193 (2009).
  12. Graphodatsky, A. S., Trifonov, V. A., Stanyon, R. The genome diversity and karyotype evolution of mammals. Molecular cytogenetics. 4, 22 (2011).
  13. Kirschvink, N., Reinhold, P. Use of alternative animals as asthma models. Current drug targets. 9, 470-484 (2008).
  14. Coleman, R. A. Of mouse and man–what is the value of the mouse in predicting gene expression in humans. Drug discovery today. 8, 233-235 (2003).
  15. Kips, J. C., et al. Murine models of asthma. The European respiratory journal. 22, 374-382 (2003).
  16. Coraux, C., Hajj, R., Lesimple, P., Puchelle, E. In vivo models of human airway epithelium repair and regeneration. European Respiratory Review. 14, 131-136 (2005).
  17. McLaughlin, R. F., Tyler, W. S., Canada, R. O. A Study of the Subgross Pulmonary Anatomy in Various Mammals. American Journal of Anatomy. , 149-165 (1961).
  18. Robinson, N. E. Some functional consequences of species differences in lung anatomy. Adv Vet Sci Comp Med. 26, 1-33 (1982).
  19. Lekeux, P., Hajer, R., Breukink, H. J. Effect of Somatic Growth on Pulmonary-Function Values in Healthy Friesian Cattle. Am J Vet Res. 45, 2003-2007 (1984).
  20. Veit, H. P., Farrell, R. L. The anatomy and physiology of the bovine respiratory system relating to pulmonary disease. Cornell Vet. 68, 555-581 (1978).
  21. Gallivan, G. J., McDonell, W. N., Forrest, J. B. Comparative pulmonary mechanics in the horse and the cow. Res Vet Sci. 46, 322-330 (1989).
  22. Hunter, K. S., et al. In vivo measurement of proximal pulmonary artery elastic modulus in the neonatal calf model of pulmonary hypertension: development and ex vivo validation. Journal of applied physiology. 108, 968-975 (2010).
  23. Stenmark, K. R., et al. Severe pulmonary hypertension and arterial adventitial changes in newborn calves at 4,300 m. Journal of applied physiology. 62, 821-830 (1987).
  24. Tian, L., et al. Impact of residual stretch and remodeling on collagen engagement in healthy and pulmonary hypertensive calf pulmonary arteries at physiological pressures. Annals of biomedical engineering. 40, 1419-1433 (2012).
  25. Van Rhijn, I., Godfroid, J., Michel, A., Rutten, V. Bovine tuberculosis as a model for human tuberculosis: advantages over small animal models. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 711-715 (2008).
  26. Otto, P., et al. A model for respiratory syncytial virus (RSV) infection based on experimental aerosol exposure with bovine RSV in calves. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 19, 85-97 (1996).
  27. Gershwin, L. J., et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 16, 1225-1236 (1998).
  28. Gershwin, L. J. Immunology of bovine respiratory syncytial virus infection of cattle. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 35, 253-257 (2012).
  29. Jaeger, J., Liebler-Tenorio, E., Kirschvink, N., Sachse, K., Reinhold, P. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation. Veterinary research. 38, 711-728 (2007).
  30. Martinez-Olondris, P., Rigol, M., Torres, A. What lessons have been learnt from animal models of MRSA in the lung. The European respiratory journal. 35, 198-201 (2010).
  31. Sadowitz, B., Roy, S., Gatto, L. A., Habashi, N., Nieman, G. Lung injury induced by sepsis: lessons learned from large animal models and future directions for treatment. Expert review of anti-infective therapy. 9, 1169-1178 (2011).
  32. Ostermann, C., et al. Infection, Disease, and Transmission Dynamics in Calves after Experimental and Natural Challenge with a Bovine Chlamydia psittaci Isolate. PloS one. 8, (2013).
  33. Ostermann, C., Schroedl, W., Schubert, E., Sachse, K., Reinhold, P. Dose-dependent effects of Chlamydia psittaci infection on pulmonary gas exchange, innate immunity and acute-phase reaction in a bovine respiratory model. Vet J. 196, (2012).
  34. Reinhold, P., et al. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one. 7, (2012).
  35. Reinhold, P., Sachse, K., Kaltenboeck, B. Chlamydiaceae in cattle: commensals, trigger organisms, or pathogens. Vet J. 189, 257-267 (2011).
  36. Dionisio, J. Diagnostic flexible bronchoscopy and accessory techniques. Revista portuguesa de pneumologia. 18, 99-106 (2012).
  37. Hilding, A. C. Experimental bronchoscopy: resultant trauma to tracheobronchial epithelium in calves from routine inspection. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 72, 604-612 (1968).
  38. Potgieter, M. M., Hopkins, F. M., Walker, R. D., Guy, J. S. Use of fiberoptic bronchoscopy in experimental production of bovine respiratory tract disease. Am J Vet Res. 45, 1015-1019 (1984).
  39. Ackermann, M. R., Kehrli Jr, M. E., Brogden, K. A. Passage of CD18- and CD18+ bovine neutrophils into pulmonary alveoli during acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veterinary pathology. 33, 639-646 (1996).
  40. Malazdrewich, C., Ames, T. R., Abrahamsen, M. S., Maheswaran, S. K. Pulmonary expression of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 in the acute phase of bovine pneumonic pasteurellosis. Veterinary pathology. 38, 297-310 (2001).
  41. Wells, A. U. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society. 19, 237-241 (2010).
  42. Wilkie, M. R. Sequential titration of bovine lung and serum antibodies after parenteral or pulmonary inoculation with Pasteurella haemolytica. Am J Vet Res. 40, 1690-1693 (1979).
  43. Pringle, J. K., et al. Bronchoalveolar lavage of cranial and caudal lung regions in selected normal calves: cellular, microbiological, immunoglobulin, serological and histological variables. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 52, 239-248 (1988).
  44. Silflow, R. M., Degel, P. M., Harmsen, A. G. Bronchoalveolar immune defense in cattle exposed to primary and secondary challenge with bovine viral diarrhea virus. Veterinary immunology and immunopathology. 103, 129-139 (2005).
  45. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Caswell, J. L. Alterations in the bovine bronchoalveolar lavage proteome induced by dexamethasone. Veterinary immunology and immunopathology. 118, 283-293 (2007).
  46. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Siwicky, M., Caswell, J. L. Stress alters the cellular and proteomic compartments of bovine bronchoalveolar lavage fluid. Veterinary immunology and immunopathology. 125, 111-125 (2008).
  47. Lordan, J. L., et al. Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells. J Immunol. 169, 407-414 (2002).
  48. Tukey, M. H., Wiener, R. S. Population-based estimates of transbronchial lung biopsy utilization and complications. Respiratory medicine. 106, 1559-1565 (2012).
  49. Braun, U., Estermann, U., Feige, K., Sydler, T., Pospischil, A. Percutaneous lung biopsy in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. 215, 679-681 (1999).
  50. Burgess, B. A., et al. The development of a novel percutaneous lung biopsy procedure for use on feedlot steers. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 75, 254-260 (2011).
  51. Sydler, T., Braun, U., Estermann, U., Pospischil, A. A comparison of biopsy and post-mortem findings in the lungs of healthy cows. Journal of veterinary medicine. A, Physiology, pathology clinical medicine. 51, 184-187 (2004).
  52. Voigt, K., et al. PCR examination of bronchoalveolar lavage samples is a useful tool in pre-clinical diagnosis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). Research in Veterinary Science. 83, 419-427 (2007).
  53. Caldow, G. Bronchoalveolar lavage in the investigation of bovine respiratory disease. In Practice. 1, 41-43 (2001).
  54. Heilmann, P., Müller, G., Reinhold, P. Bronchoscopy and Segmental Bronchoalveolar Lung Lavage of Anesthetised Calf. Monatsh. Veterinärmed. 43, 79-84 (1988).
  55. Gogolewski, R. P., et al. Protective ability and specificity of convalescent serum from calves with Haemophilus somnus pneumonia. Infection and immunity. 55, 1403-1411 (1987).

Tags

Bovine LungBiomedical ResearchBronchoscopyIntrabronchial InoculationIn Vivo SamplingRespiratory MedicineAnimal ModelsPulmonary DiseaseChlamydia PsittaciBronchoalveolar LavageBronchial BrushingTransbronchial Lung Biopsy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image