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Medicine

Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et<em> In Vivo</em> Techniques d'échantillonnage

Published: July 03, 2014
doi:
10.3791/51557
, , ,
1Institute of Molecular Pathogenesis,Friedrich-Loeffler-Institut

Summary

Cet article décrit les techniques endoscopiques dans les poumons de bovins dans des conditions expérimentales, c'est à dire l'inoculation bronchoscopie guidée, lavage broncho-alvéolaire, brossage bronchique et une biopsie pulmonaire transbronchique.

Abstract

Il ya une recherche constante de modèles animaux de substitution dans la recherche de la médecine respiratoire. Selon le but de la recherche, de grands animaux comme modèles de maladie pulmonaire ressemblent souvent la situation du poumon humain beaucoup mieux que les souris font. Travailler avec de grands animaux offre aussi l'occasion de goûter le même animal plusieurs reprises sur une certaine ligne de temps, ce qui permet des études à long terme sans pour autant sacrifier les animaux.

L'objectif était d'établir des méthodes d'échantillonnage in vivo dans pour l'utilisation dans un modèle de bovin d'un infection à Chlamydia psittaci respiratoire. L'échantillonnage doit être effectué à divers points de temps dans chaque animal au cours de l'étude, et les échantillons doivent être appropriés pour étudier la réponse de l'hôte, ainsi que de l'agent pathogène dans des conditions expérimentales.

Bronchoscopie est un outil diagnostique utile en médecine humaine et vétérinaire. Il est une procédure sûre et peu invasive. Cette article décrit l'inoculation intrabronchique des veaux ainsi que les méthodes d'échantillonnage pour les voies respiratoires inférieures. Vidéoendoscopique, inoculation intrabronchiale conduit à des résultats cliniques et pathologiques très cohérentes dans tous les animaux inoculés et est, par conséquent, bien adapté pour une utilisation dans des modèles de maladie infectieuse du poumon. Les méthodes d'échantillonnage décrites sont lavage broncho-alvéolaire, brossage bronchique et une biopsie pulmonaire transbronchique. Tous ces éléments sont des outils de diagnostic précieux en médecine humaine et pourraient être adaptés à des fins expérimentales à veaux âgés de 6-8 semaines. Les échantillons obtenus ont été adaptés à la fois pour la détection et la caractérisation d'agents pathogènes de la gravité de l'inflammation pulmonaire chez l'hôte.

Introduction

Les valeurs des grandes modèles animaux en recherche biomédicale

En recherche biomédicale interdisciplinaire moderne, les modèles animaux sont encore indispensables pour élucider les interactions complexes – en matière de santé ou d'un état de maladie – dans les organismes de mammifères. Malgré 17 prix Nobel étant attribués à des scientifiques qui ont étudié les bovins, les chevaux, les moutons, ou de la volaille en tant que modèles pour la recherche biomédicale 1, de nos jours la grande majorité des expériences sur les animaux sont entrepris avec des rongeurs, alors que moins de 1% des études travaillent avec des animaux domestiques ou le bétail.

Les petits animaux offrent de nombreux avantages pratiques (c. low cost, malléabilité génétique, haut débit, la disponibilité de nombreux génétique, et les outils et les kits immunologiques), et des modèles murins génétiquement modifiés sont généralement acceptées pour effectuer des études mécanistiques découverte voies moléculaires particulières. Dans la recherche biomédicale de systèmes complexes, til pertinence biologique et l'utilité clinique de modèles de souris est de plus en plus discutable. Ils pourraient être trompeuse et assumer le risque d'une simplification excessive de la complexité biologique 2-9.

En raison de particularités inter-espèces, aucune espèce animale simples seront complètement refléter la situation humaine, et l'utilisation de plus d'un modèle qui semble être bénéfique dans une approche interdisciplinaire de la recherche biomédicale. Dans le cadre de la médecine translationnelle, les grands animaux offrent la possibilité de servir de modèles comparatifs fournir des résultats présentant un intérêt biologique élevé de double usage à la fois humaine et la santé animale 1. Remarquablement, le génome humain est plus étroitement ressemblait par le génome bovin que par le génome des rongeurs de laboratoire. Il a également été confirmé récemment que, par rapport à d'autres taxa, le génome de la souris est beaucoup plus réarrangé 10-12.

Dans une conception de l'étude complexe, l'utilisation de l'élevage offre la uniqoccasion ue du commerce intra-individuelles, des études à long terme par la collecte répétée d'une variété d'échantillons in vivo d'un-et-le-même individuum sans sacrifier l'animal. Par conséquent, des modifications fonctionnelles, inflammatoires et morphologiques peuvent être suivis dans le même sujet sur ​​une certaine période de temps 13.

Le bovine poumon comme un modèle respiratoire approprié

En raison du nombre élevé de différences significatives dans l'anatomie du poumon, de la physiologie respiratoire et d'immunologie pulmonaire, les souris ne reproduisent pas de nombreux aspects physiopathologiques importants de la maladie pulmonaire humain. Ceci doit être pris en compte lors de leur utilisation en tant que modèles animaux de maladie respiratoire 2,9,14-16. Bien que les particularités de l'anatomie et la structure existent pour chaque poumon chez les mammifères, les caractéristiques fonctionnelles (c. volumes pulmonaires, les débits d'air et la mécanique respiratoire) sont mieux comparables entre les humains adultes et les veaux en raison de poids de corps similaires(50-100 kg).

Les spécifiques aux espèces caractéristiques du poumon bovin se résument comme suit: le poumon gauche se compose de deux lobes (de cranialis de Lobus, qui est divisé en deux segments, et lobus caudalis), tandis que le poumon droit est composé de quatre lobes (lobus cranialis, lobus medius, lobus caudalis, et lobus accessorius). Contrairement à l'anatomie du poumon de la plupart des autres mammifères, la bronche droite des branches du lobe crânien directement à partir de la face latérale droite de la trachée. En ce qui concerne subgross anatomie, le poumon de bovin présente un haut degré de lobulation et un pourcentage élevé de tissu interstitiel 17,18 conduisant à une compliance pulmonaire spécifique relativement faible et une résistance du tissu pulmonaire supérieure 19. Par conséquent, l'activité respiratoire nécessaire est relativement élevé par rapport à d'autres espèces 20,21. Le degré élevé de lobulation conduit à une forte indépendance des segments. Ainsi, inflammatory processus sont limités par des cloisons de tissu conjonctif, et les segments malades et sains sont souvent à l'intérieur du même lobe. En raison du manque de voies aériennes collatérales, le poumon de bovin est particulièrement adapté pour refléter les dysfonctionnements pulmonaires obstructives 13. En ce qui concerne le système vasculaire dans les poumons bovine, les petites artères pulmonaires montrent des couches musculaires lisses très importants. Par conséquent, le veau peut également servir de modèle animal bien établi de l'hypertension pulmonaire ou vasculaire remodelage 22-24.

En ce qui concerne les infections respiratoires, les maladies d'origine naturelle existent dans le bétail qui partagent de nombreuses similitudes avec la maladie comparable chez l'homme. Des exemples typiques sont la tuberculose bovine 25, le virus respiratoire syncytial (VRS) chez les veaux des infections 26-28, ou des infections de chlamydia naturellement acquis 29. Ainsi, les grands modèles animaux ne se ressemblent de près la situation dans l'hôte naturel. Par conséquent, elles sont plus useful pour étudier les interactions hôte-pathogène et la physiopathologie complexe de la maladie correspondante des êtres humains 30,31.

Comme un modèle biologiquement pertinente respiratoire infection à Chlamydia psittaci, les veaux ont été choisis car les bovins représentent hôtes naturels de cet agent pathogène 32-35. Les informations obtenues à partir de ce modèle, par rapport à la pathogenèse de la maladie ou les voies de transmission possibles entre les animaux et les humains, aidera à élargir notre connaissance des impacts dans le bétail et l'homme. Le modèle peut également aider à vérifier que les options thérapeutiques alternatives généralement reconnus et pour l'élimination de la pulmonaire C. infections psittaci, ce qui est, encore une fois, de l'intérêt pour la médecine humaine et vétérinaire.

Techniques appliquées aux échantillons et Disponible auprès de l'appareil respiratoire bovine

Cet article décrit et illustre les techniques et les méthodes de diagnostic applicable pour le poumon de bovin et utilisé dans notre modèle pour évaluer à la fois les effets de l'agent pathogène sur le poumon de mammifère et l'efficacité de l'intervention thérapeutique.

Bronchoscopie a été réalisée en médecine humaine depuis les années 1960 et est considéré comme une procédure sûre 36. Chez les veaux, la bronchoscopie expérimentale a été décrite en 1968 pour la première fois 37. L'application intrabronchique des agents pathogènes a été suggéré par Potgieter et al. Comme une méthode fiable pour produire une maladie des voies respiratoires inférieures chez les veaux 38 et est maintenant une méthode très répandue dans la recherche bovine 34,39,40. Intrabronchique inoculation d'une quantité définie de l'agent pathogène sous contrôle vidéoendoscopique permet un placement sélectif de l'agent infectieux dans le poumon. Cela conduit à des résultats cliniques et pathologiques cohérentes dans tous les animaux 34 et permet l'échantillonnage ciblé des régions pulmonaires qui devraient être modifiées en raison de l'exposition de l'agent pathogène.

<pclass = "jove_content"> le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) est un indicateur bien décrit la présence et la sévérité de l'inflammation du poumon. Le lavage broncho-alvéolaire (BAL) est une procédure standard en médecine humaine pour le diagnostic d'une variété de maladies respiratoires 41. Chez les bovins vivants, BAL a été introduit par Wilkie et Markham à la fin des années soixante-dix du siècle dernier 42. Il a été considéré comme une technique sûre et reproductible pour étudier les voies respiratoires inférieures des bovins. En raison de l'absence de données suffisantes sur les paramètres de BALF chez les animaux sains, en 1988 Pringle et al. Effectuée BAL sur des veaux en bonne santé avec un fibroscope souple. Les auteurs ont également souligné la nécessité de normaliser les protocoles BAL dans des conditions expérimentales d'acquérir des résultats comparables 43. BAL est encore utilisé comme une méthode d'échantillonnage in vivo chez les veaux de 44 à 46.

Brossage bronchique est couramment utilisé en médecine humaine en tant queoutil de diagnostic pour déguster lésions néoplasiques ou pour l'analyse microbiologique 36. Pour des fins de recherche, des cultures de cellules primaires de cellules épithéliales récoltées par brossage cytologique peuvent être obtenus 47. Chez les bovins, l'utilisation de brossages bronchiques pour l'analyse microbiologique a été décrit pour caractériser l'environnement microbien du poumon 43.

Biopsie pulmonaire transbronchique fournit des échantillons de tissus pulmonaires et est un outil diagnostique utile pour diffuser les maladies pulmonaires chez les humains. Pneumothorax iatrogène et une hémorragie liée à l'intervention sont les complications associées à cette technique. Leur incidence est signalé comme étant à moins de un pour cent 48 chez les patients humains. Biopsie pulmonaire transbronchique n'est pas une méthode courante pour l'utilisation chez les bovins, en raison du coût élevé de l'équipement nécessaire et le temps nécessaire pour obtenir des biopsies. Au lieu de cela, des biopsies transcutanées pulmonaires sont plus pratiques dans des conditions réelles de 49 à 51.

Protocol

Déclaration d'éthique Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec le droit européen et national pour le soin et l'utilisation des animaux. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale et la protection des animaux dans l'Etat de Thuringe, Allemagne (numéro de permis: 04-004/11). Toutes les expériences ont été réalisées sous la supervision de l'agent institutionnel autorisé pour la protection des animaux. Bronchoscopie était strictement réalisée sous anesthésie générale. Au cours de l'étude, tous les efforts ont été faits pour minimiser l'inconfort ou la souffrance. Remarques générales Les techniques décrites ont été mises au point pour veaux d'environ 6 à 8 semaines d'âge, pesant environ 60-80 kg. Pour l'utilisation dans d'autres espèces animales ou grands veaux différence d'âge et le poids corporel, les techniques doivent être adaptées à la taille et le poids et prendre en compte l'anatomie du poumon de l'espèce animale particulière. Tousle matériel utilisé doit être stérile. Chlamydia psittaci est une bactérie zoonotique qui peuvent causer des maladies respiratoires et générale chez l'homme. Le C. non-aviaire souche psittaci DC15 utilisée dans le présent protocole doit être traitée sous le niveau de biosécurité 2. Tout travail avec le pathogène et avec des animaux infectés doivent être effectués de porter un équipement de protection individuelle, comme un masque, une combinaison étanche de démarrage, des bottes de caoutchouc et des gants. Le port d'un appareil respiratoire approprié est d'une grande importance, étant donné que la voie naturelle de l'infection à C. psittaci est aerogen. Emballage et étiquetage des échantillons doit être la preuve désinfectant puisque toutes les choses doivent être traités avec un désinfectant efficace contre Chlamydia selon les instructions du fabricant avant de quitter l'unité de logement des animaux. 1. Préparation de l'animal pour la bronchoscopie Déterminer le poids du veau pour le dosage des anesthésiques. Placez une intraveineuse (IV) l'accès in la veine jugulaire gauche. En premier lieu, injecter lentement xylazine (0,2 mg / kg de poids corporel) pendant environ 30 secondes, puis, après une sédation se produit, injecter de la kétamine (2,0 mg / kg de poids corporel). Soulever l'animal sur la table et placer en décubitus latéral droit. Une fois l'animal est positionné correctement sur la table, vérifiez si l'accès IV est toujours en place et réajuster si nécessaire. Pendant l'anesthésie, consultez régulièrement le réflexe de la paupière pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Une fois l'animal respire régulièrement, avoir quelqu'un tirer la langue et étirer le cou. Placer un spéculum de tube métallique dans la bouche de l'animal, à l'aide de légers mouvements de rotation. Poussez le spéculum avant sous le contrôle de la vue, en utilisant une lampe de poche, jusqu'à la larynx est visible. Maintenir l'anesthésie pendant toute la procédure endoscopique par injection d'un bolus de 7 mg de xylazine et de kétamine à 70 mg selon les besoins. . 2 inoculation (Sites inoculation: Figure 1) </p> Préparer trois seringues avec des inoculum, contenant 1, 2, et 5 ml de l'inoculum. Insérez un tube de Teflon dans le canal de travail de l'endoscope. Le tube ne doit pas dépasser de la pointe de l'endoscope. Insérez l'endoscope à travers le spéculum de métal. Légers réajustements du spéculum peut être nécessaire pour permettre le passage du larynx. La trachée bronches, qui bifurque à droite, permet d'aligner l'image sur le moniteur. Fixer la seringue avec 5 ml d'inoculum à l'extrémité du tube en Téflon. Naviguer dans le tube dans les branches où l'inoculum est déposé et appliquer la quantité souhaitée (du poumon droit: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml et 1,0 ml; Poumon gauche: cranialis Lobus, Pars cranialis : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Fixer la seringue avec 1 &# 160; ml d'inoculum dans le tube, puis accédez à la trachée des bronches et du dépôt de l'inoculum (de cranialis Lobus, Pars caudalis: 1,0 ml). Il est utile d'aborder toujours les localisations dans le même ordre. Retirer l'endoscope et le spéculum. Pulvériser 1 ml de l'inoculum dans chaque narine d'un actionneur. Apportez le dos de l'animal à l'écurie et le placer en décubitus ventral pour se réveiller. Ne pas laisser l'animal sans surveillance ou en compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternal. L'écurie de récupération devrait être de l'air conditionné, car la capacité de l'animal pour la thermorégulation est réduite sous anesthésie générale. REMARQUE: Les premiers signes cliniques devraient se produire sur 24-36 h après l'inoculation, en fonction de l'agent pathogène utilisé. . 3 procédures d'échantillonnage (Sites d'échantillonnage: Figure 2) Préparer l'animal comme décrit dans les étapes 01.01 à 01.06. Lavage bronchoalvéolaire Placez 5 seringues contenant chacune 20 ml de soluté isotonique stérile, dans un bain-marie et les laisser se réchauffer à environ 38 ° C. Insérer un cathéter de lavage dans le canal de travail de l'endoscope, puis insérez l'endoscope dans le spéculum de métal et naviguer vers l'avant dans la bronche principale du poumon gauche jusqu'à la position "coin" est atteint lorsque l'endoscope ne peut être poussé plus loin en avant. Un après l'autre, attachent les seringues avec la solution de NaCl chaud au cathéter de lavage, instiller le liquide et aspirer directement. Le fluide de lavage broncho-alvéolaire doit être stocké dans des bouteilles en verre siliconé et mise sur de la glace immédiatement après récupération pour empêcher les macrophages alvéolaires de se fixer à la surface du verre. Notez la fois la quantité de solution saline et instillé la quantité de fluide récupéré. Retirer le cathéter de lavage du canal de travail. Brossage bronchique Naviguez dans l'endoscope à l'emplacement d'échantillonnage désirée, dans le protocole décrit c'est le Bifurcatio trachées. Couvrir la brosse avec le tube avant de l'insérer dans le canal de travail de l'endoscope jusqu'à ce que la pointe du pinceau apparaît sur l'écran. Poussez la brosse avec le tube de plastique avant d'environ 5 cm et de découvrir à partir du tube en plastique en appuyant sur la poignée, puis accédez à l'emplacement qui doit être brossé. Frottez les appels épithéliales en poussant doucement et en tirant la brosse d'avant en arrière lors de la navigation de l'endoscope pour assurer le contact entre la brosse et la paroi de la bronche. Arrêtez de frotter lorsque le saignement se produit. Couvrir la brosse avec le tube avant de la retirer du canal de travail. Préparez-vous à cinq frottis sur des lames de microscope en roulant doucement le pinceau sur la diapositive. Fixer les frottis dans du méthanol froid pendant 10 min, l'air sec et conserver à -20 ° C. La brosse peut être rincé à l'divers médias, selon le but des cellules prélevées. Si vous prenez plusieurs brossages avec le même pinceau, assurez-vous de ne rincer dans les médias qui ne sont pas irriter la muqueuse. Biopsie pulmonaire transbronchique Naviguez dans l'endoscope à l'emplacement d'échantillonnage désirée, dans le protocole décrit c'est le caudalis Pars des cranialis Lobus. Avant d'insérer la pince à biopsie dans le canal de travail ouvert et fermer une couple de fois pour s'assurer qu'il fonctionne bien. Poussez les pinces à biopsie dans la branche caudale des bronches trachée jusqu'à ce qu'une légère résistance se produit. Tirez 2-3 cm, ouvrir la pince, faire avancer d'environ 2 cm, fermer la pince, retirer et retirer la pince du canal de travail. Cela nécessite un peu de pratique. Retirez délicatement le tissu de la pince à biopsie, en utilisant une aiguille ou une petite pince. Selon l'utilisation ultérieure du tissu, de la stocker dans nitr liquidedu fibrinogène ou un milieu de fixation approprié. Cela devrait se faire juste après l'enlèvement de prévenir les processus d'autolyse. Le traitement post-opératoire Apportez le dos de l'animal à l'écurie et le placer en décubitus ventral pour se réveiller. Ne pas laisser l'animal sans surveillance ou en compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternal. L'écurie de récupération devrait être de l'air conditionné, car la capacité de l'animal pour la thermorégulation est réduite sous anesthésie générale. Surveillance de l'animal de près les signes de pneumothorax pour le 24 heures suivant. Fournir des aliments et de l'eau douce lorsque l'animal a retrouvé la pleine conscience.

Representative Results

Évolution de la maladie L'effet de l'agent pathogène sur la santé des animaux peut être évaluée par un examen clinique. Dans nos modèles d'infection des voies respiratoires, les animaux ont été examinés deux fois par jour et des observations cliniques ont été enregistrés en utilisant un système de notation. Informations complémentaires a été capturé par l'exécution d'autres méthodes in vivo dans d'échantillonnage, par exemple, la collecte de sang et de prélèvements ou de mesure de la fonction pulmonaire. Des examens pathologiques ont été effectuées à différents points de temps après l'inoculation pour décrire l'état d'avancement de l'infection de 32 à 34. BALF Taux de récupération Le débit du fluide inculqué de récupération était 83,05 ± 4,58% (moyenne ± écart-type). détection de pathogènes La remise en culture de l'agent pathogène peut être effectuée à partir de brossages bronchiques. En outre, le criblage par PCR des différents échantillons est possible de détecter l'agent pathogène, par exemple tibiopsie ssu, échantillon de brosse de cytologie, BALF cellules 52 ou pharyngée écouvillon. La visualisation de l'agent pathogène est possible en effectuant immunohistochimie de coupes congelées de biopsies de poumon et de préparations de sédimentation des cellules BALF (Figure 3). Dans les expériences précédentes, la PCR d'échantillons de sang et d'écouvillons (conjonctival, les selles, nasales) ont été réalisées pour caractériser la propagation et l'excrétion de l'agent pathogène 32. Marqueurs de l'inflammation locale des tissus pulmonaires Dans le BALF, différents paramètres de l'inflammation pulmonaire peuvent être étudiés. Le nombre total de cellules et le pourcentage de neutrophiles augmente généralement lorsque l'inflammation pulmonaire est présent. Pour la différenciation des cellules, des préparations de sédimentation de BALF cellules peuvent être colorées selon Giemsa et différenciées en utilisant immersion dans l'huile (figure 4). Proportions cellulaires et liquide du BALF sont séparées par centrifugation (300 x g, 20 min). Le BALF-Surnageant contient divers marqueurs qui changent au cours des processus inflammatoires dans les poumons et peuvent être étudiés dans des conditions expérimentales. Les exemples sont des protéines totales et 29,34 eicosanoïdes. Une vue d'ensemble schématique de la poursuite de l'utilisation potentielle des échantillons décrits est représenté sur la figure 5. Figure 1. Schéma du poumon de bovin avec des sites d'inoculation (en jaune). Les nombres indiquent l'ordre dans lequel l'inoculum est administré dans l'autre bronches. R: right; L: gauche. Poumon droit: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml et 1,0 ml 4; Poumon gauche: cranialis Lobus, <strong> 5 Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 cranialis de Lobus, Pars caudalis: 1,0 ml. . Figure 2 Schéma du poumon bovin avec des sites d'inoculation (de jaune) et les sites d'échantillonnage:. Lavage broncho-alvéolaire (bleu), brossage bronchique (vert), et la biopsie pulmonaire (orange) Notez que tous les échantillons sont obtenus à partir des régions où le pathogène a été déposé avant. R: droite, L: gauche. Figure 3. A) la biopsie pulmonaire à partir d'un veau inoculé avec Chl amydia psittaci 4 jours après l'inoculation (dpi), b) les sédiments cellulaire de BALF partir d'un veau inoculé avec C. psittaci 9 dpi. Marquage immunohistochimique pour les chlamydiae. Les inclusions (flèches) sont présentes dans le poumon (a) et dans des macrophages alvéolaires (b). Hematoxylin de contraste. Figure 4. Des sédiments cellulaire de BALF partir d'un veau inoculés avec C. psittaci 9 dpi. macrophages alvéolaires (n) sont le type cellulaire prédominant dans la BALF. Le montant des granulocytes neutrophiles (*) augmente lorsque les processus inflammatoires sont présents. Modifié coloration Pappenheim. ES.jpg "width =" 600 "/> Figure 5. Des méthodes possibles pour la préparation de l'échantillon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Procédé endoscopique d'inoculation a été développé et diverses méthodes d'échantillonnage bronchoscopiques été adapté pour être utilisé dans les grands animaux dans des conditions expérimentales. Les techniques décrites sont faciles à apprendre, même pour les examinateurs ayant peu d'expérience en endoscopie. Le processus de la bronchoscopie est peu invasive et sans effets indésirables associés aux méthodes de l'inoculation, ainsi que les méthodes d'échantillonnage décrites (BAL, biopsie pulmonaire transbronchique, brossage bronchique), n'a jamais été vu dans aucun des animaux. Les complications associées à des biopsies pulmonaires transbronchiques chez l'homme sont les saignements et de pneumothorax 48, aucune n'a été vu dans les veaux qui ont subi cette procédure. La biopsie pulmonaire transbronchique prend plus de temps et nécessite plus de matériel que la méthode transcutanée, mais il est moins invasive et ne porte pas le risque d'infection de la plaie.

La méthode endoscopique contrôlée visuellement de inoculation permet le dépôt d'une quantité définie de l'agent pathogène dans des sites spécifiques du poumon. Ainsi, il résulte des constatations cliniques et pathologiques très cohérentes dans tous les animaux inoculés 32-34. Toutefois, il ne ressemblait pas à toutes les caractéristiques de l'infection naturelle chez les veaux. Dans un modèle de C. respiratoires infection psittaci, la technique décrite d'inoculation a conduit à des lésions pulmonaires associées aux sites de placement de l'agent pathogène 34, alors que, dans les infections acquises naturellement veaux développent habituellement une pneumonie des lobes apicaux. Ce fait doit être pris en compte lors de l'interprétation de la pertinence des résultats expérimentaux dans le contexte des infections pulmonaires acquises naturelles chez les bovins.

Vidéoendoscopique BAL permet l'échantillonnage d'une zone définie du poumon. A des fins expérimentales, il s'agit d'un avantage par rapport à l'utilisation d'un cathéter nasal en aveugle. En raison de l'anatomie du poumon bovin, le cathéter inséré aveuglément serait pousséeed au lobe diaphragmatique droite dans la plupart des cas 53,54 et l'examinateur n'a aucune influence sur la zone du poumon qui est lavaged. Un autre avantage de la BAL endoscopique chez les veaux anesthésiés en décubitus latéral est le taux de récupération moyen élevé de fluide inculqué de plus de 80%. Une comparaison avec d'autres études révèlent que, en position debout, les veaux sous sédation, une reprise de 133,3 ± 1,6 ml 46 et 127,13 ± 3,53 ml 45 après l'instillation de 240 ml de liquide dans le lobe caudal est rapporté. Chez les veaux sédation en décubitus sternal 51% du fluide insufflé peut être récupéré à partir du lobe cranial et 62% par rapport au lobe caudal 43. Cela signifie que la moitié environ du liquide instillé a pu être retrouvé en position verticale du mollet. Selon la quantité de BALF nécessaire à la poursuite préparation de l'échantillon, cela pourrait ne pas laisser suffisamment de matière pour effectuer toutes les expériences souhaitées. BAL chez les bovins a été utilisé par de nombreux groupes de recherche et de nombreuxdifférents paramètres ont été examinés dans différentes conditions. La plupart des auteurs ont effectué le lavage des lobes basilaires 43,45,46, mais la quantité de liquide utilisée pour le lavage diffère entre les groupes de recherche. Cela conduit à des incohérences dans la dilution des cellules récupérées, de protéines et d'autres substances, ce qui rend difficile de comparer les résultats de différentes publications. Par conséquent, l'utilisation chez les bovins, il est recommandé de lavage avec cinq fractions de 20 ml (soit 100 ml au total) corps chaud, une solution saline isotonique, qui sont récupérés immédiatement après l'instillation. Lors de l'utilisation d'un cathéter à un lavage avec un grand diamètre (par exemple> 2 mm), le volume de chaque fraction a besoin d'être augmenté légèrement, en fonction de la quantité de fluide qui reste dans le cathéter.

L'anatomie très segmenté du poumon bovine conduit à une limitation méthodique; les résultats obtenus à partir d'une partie du poumon peuvent ne pas être vrai pour le reste du poumon. Comme il n'y a pas d'contrôle de la vue de l'ensemble de la zone du poumon sondé par biopsie transbronchique et lavage, l'examinateur ne peut pas savoir si les zones échantillonnées étaient en bonne santé ou malade. Par conséquent, il est très important d'échantillonner les endroits où l'agent pathogène a été inoculé avant afin d'avoir un taux de récupération élevé de l'agent pathogène et d'avoir une plus grande possibilité d'échantillonner les zones pulmonaires malades. Une autre limite est le risque anesthésique augmenté chez les animaux de mauvais état clinique. Les méthodes décrites ne doivent être utilisés dans les modèles d'intensité légère à modérée de la maladie de maintenir la charge pour les animaux aussi bas que possible. L'anesthésie générale chez les ruminants doivent toujours être aussi court que possible, comme le développement de gaz dans le rumen augmente le risque anesthésique dans ces espèces. Les animaux doivent être placés en décubitus ventral immédiatement après la bronchoscopie pour permettre l'écoulement du gaz mis au point et doivent être étroitement surveillés jusqu'à ce qu'ils soient complètement récupéré de l'anesthésie. En outre, les techniques décrites ne sont pas Suitable pour échantillonner des intervalles de moins de 24 heures.

Le protocole décrit peut être adapté à d'autres agents infectieux. Inoculation endoscopique de divers agents pathogènes a été décrite, par exemple C. psittaci 32-34, haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, et le virus de la diarrhée virale bovine 44. En outre, les sites de dépôt des agents pathogènes dans les poumons peuvent être adaptées au modèle désiré. Lors du choix des sites d'échantillonnage, quelques faits importants doivent être pris en compte: les sites (i) d'échantillonnage doivent être choisis en fonction de l'emplacement de l'inoculation et sur les résultats attendus pathologiques. (Ii) Lorsque l'autopsie doit être effectuée, il faut veiller à laisser suffisamment de zones pulmonaires non échantillonnées pour ex échantillonnage in vivo. (Iii) l'emplacement des sites d'échantillonnage doivent être choisis de telle sorte qu'ils puissent être atteints avec l'équipement. En particulier pour biopsie pulmonaire transbronchique, il existe des limitations dues à la longueur des pinces à biopsie. (Iv) Til commande l'échantillonnage est important, brossage bronchique et une biopsie pulmonaire transbronchique pourraient conduire à un saignement mineur, qui contaminerait l'BALF. Par conséquent, BALF doit toujours être obtenu en premier. Lors de l'utilisation du protocole chez d'autres espèces, l'anatomie du poumon spécifique de l'espèce doit être prise en compte.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors are very thankful to the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) of Germany for the funding of their work. Also, the authors thank Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel and all the other colleagues working in the team of the animal house (FLI, Germany) for their technical assistance with the bronchoscopies. They are very thankful to Maria-Christina Haase (FLI, Germany) for her help in providing literature. Furthermore, the authors wish to express their gratitude to Dr. Angela Berndt (FLI, Germany) and Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) for critical reading of the manuscript.

Materials

Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2,2 mm, working length 140 cm
lavage catheter  Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
acuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10  working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess  Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter 1.2 mm, length 43 mm
Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
metal tube speculum  n/a n/a diameter: 3.5 cm, length: 35 cm
flashlight n/a n/a
siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
inoculum n/a dilute pathogen in 8mL buffer
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Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).
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