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Medicine

La broncoscopia guiada visualmente, intrabronquial Inoculación e: El pulmón bovino en la Investigación Biomédica<em> En Vivo</em> Técnicas de Muestreo

Published: July 03, 2014
doi:
10.3791/51557
, , ,
1Institute of Molecular Pathogenesis,Friedrich-Loeffler-Institut

Summary

En este artículo se describen las técnicas de broncoscopia en el pulmón bovino en condiciones experimentales, es decir, la inoculación broncoscópicamente guiada, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial y biopsia pulmonar transbronquial.

Abstract

Hay una constante búsqueda de modelos animales alternativos en la investigación de la medicina respiratoria. Dependiendo del objetivo de la investigación, animales grandes como modelos de la enfermedad pulmonar menudo se asemejan a la situación del pulmón humano mucho mejor que los ratones hacen. Trabajar con animales de gran tamaño también ofrece la oportunidad de probar el mismo animal en repetidas ocasiones durante un cierto paso del tiempo, lo que permite estudios a largo plazo sin sacrificar los animales.

El objetivo era establecer métodos de muestreo en vivo para el uso en un modelo bovino de una infección de Chlamydia psittaci respiratorio. El muestreo se realizará en varios puntos de tiempo en cada animal durante el estudio, y las muestras debe ser adecuado para estudiar la respuesta del huésped, así como el patógeno en condiciones experimentales.

La broncoscopia es una valiosa herramienta de diagnóstico en medicina humana y veterinaria. Se trata de un procedimiento seguro y mínimamente invasivo. Este árticole describe la inoculación intrabronquial de los terneros, así como métodos de muestreo para el tracto respiratorio inferior. Videoendoscópico, la inoculación intrabronquial conduce a hallazgos clínicos y patológicos muy consistentes en todos los animales inoculados y es, por lo tanto, muy adecuado para su uso en modelos de enfermedad pulmonar infecciosa. Los métodos de muestreo descritos son el lavado broncoalveolar, cepillado bronquial y biopsia pulmonar transbronquial. Todas estas son valiosas herramientas de diagnóstico en la medicina humana y podrían ser adaptados con fines experimentales a terneros de 6-8 semanas. Las muestras obtenidas fueron adecuados tanto para la detección de patógenos y caracterización de la gravedad de la inflamación pulmonar en el huésped.

Introduction

Los valores de los grandes modelos animales en la investigación biomédica

En la investigación biomédica moderna interdisciplinario, los modelos animales siguen siendo indispensables para dilucidar las interacciones complejas – relacionado con la salud o un estado de la enfermedad – en organismos mamíferos. A pesar de 17 premios Nobel que se adjudiquen a los científicos que estudiaron el ganado, caballos, ovejas, aves de corral o de modelo para la investigación biomédica 1, en ​​la actualidad la gran mayoría de los experimentos con animales se llevan a cabo con los roedores, mientras que menos del 1% de los estudios están trabajando con los animales domésticos o ganado.

Los animales pequeños ofrecen muchas ventajas prácticas (es decir, de bajo costo, maleabilidad genética, de alto rendimiento, la disponibilidad de numerosos factores genéticos y herramientas y kits inmunológicos), y los modelos murinos transgénicos son generalmente aceptados para realizar estudios sobre el mecanismo descubriendo particulares vías moleculares. En la investigación biomédica de los sistemas complejos, tél relevancia biológica y la utilidad clínica de los modelos de ratones se está volviendo más y más cuestionable. Podrían ser engañosa y asumir el riesgo de la simplificación excesiva de la complejidad biológica 2-9.

Debido a las peculiaridades entre especies, ninguna especie animal individuales reflejarán completamente la situación humana, y el uso de más de un modelo que parece ser beneficioso en un enfoque interdisciplinario de la investigación biomédica. En el contexto de la medicina traslacional, animales de gran tamaño ofrecen la oportunidad de servir como modelos comparativos proporcionar resultados con alta importancia biológica de doble uso para la salud tanto humana como de los animales 1. Cabe destacar que el genoma humano está más estrechamente se parecía por el genoma bovino que por el genoma de los ratones de laboratorio. También se ha confirmado recientemente que, en comparación con otros taxones, el genoma de los ratones es mucho más reordenado 10-12.

En un diseño de estudio complejo, el uso de la ganadería ofrece la uniqoportunidad de UE, estudios intra-individuales a largo plazo por repetida colección de una variedad de muestras in vivo de uno-y-el-mismo individuum sin sacrificar el animal. Por lo tanto, los cambios funcionales, inflamatorias y morfológicas pueden ser controlados en el mismo sujeto a lo largo de un cierto período de tiempo 13.

El pulmón bovino como un modelo de respiración adecuado

Debido al alto número de diferencias significativas en la anatomía de pulmón, la fisiología respiratoria, y la inmunología pulmonar, los ratones no se reproducen muchos aspectos fisiopatológicos importantes de la enfermedad pulmonar humano. Esto debe ser tenido en cuenta a la hora de usarlos como modelos animales de enfermedad respiratoria 2,9,14-16. Aunque existen peculiaridades de la anatomía y la estructura para cada pulmón de mamíferos, las características funcionales (es decir, los volúmenes pulmonares, los flujos de aire y la mecánica respiratoria) son mejores comparables entre los seres humanos adultos y terneros debido a los pesos corporales similares(50-100 kg).

Las características de la pulmón bovino especies específicas se resumen de la siguiente manera: el pulmón izquierdo consta de dos lóbulos (craneal lobus, que se divide en dos segmentos, y caudalis lobus), mientras que el pulmón derecho consta de cuatro lóbulos (lobus craneal, lobus medius, caudalis lobus y accessorius lobus). A diferencia de la anatomía de pulmón de la mayoría de otros mamíferos, el bronquio de las ramas de los lóbulos craneales derecho directamente desde la cara lateral derecha de la tráquea. Con respecto a la anatomía subgross, el pulmón bovino presenta un alto grado de lobulado y un alto porcentaje de tejido intersticial 17,18 conduce a una distensibilidad pulmonar específica relativamente baja y una resistencia del tejido pulmonar superior 19. Por lo tanto, la actividad de respiración requerido es bastante alta en comparación con otras especies 20,21. El alto grado de lobulación conduce a una fuerte independencia de los segmentos. De este modo, INFprocesos lammatory son limitados por tabiques de tejido conectivo, y los segmentos enfermos y sanos a menudo se encuentran en el mismo lóbulo. Debido a la falta de vías respiratorias colaterales, el pulmón bovino es particularmente adecuado para reflejar las disfunciones pulmonares obstructivas 13. Con respecto a la vasculatura en el pulmón bovino, las pequeñas arterias pulmonares muestran capas musculares lisas muy prominentes. Por lo tanto, el ternero también puede servir como un modelo animal bien establecido de hipertensión pulmonar o remodelamiento vascular 22-24.

Con respecto a las infecciones respiratorias, existen enfermedades de origen natural en el ganado que comparten muchas similitudes con la enfermedad comparables en el hombre. Los ejemplos típicos son la tuberculosis bovina 25, (VSR), las infecciones en los terneros de 26-28, o infecciones por Chlamydia adquiridos naturalmente 29 virus sincitial respiratorio. Por lo tanto, los modelos animales grandes no se parecen mucho a la situación en el huésped natural. Por lo tanto, son más useful para el estudio de las interacciones huésped-patógeno y la compleja fisiopatología de la enfermedad correspondiente en seres humanos 30,31.

Como un modelo biológicamente relevante de infección Chlamydia psittaci respiratoria, fueron elegidos los terneros ya los bovinos representan huéspedes naturales para este patógeno 32-35. La información obtenida de este modelo, con respecto a la patogénesis de la enfermedad o las posibles vías de transmisión entre los animales y los seres humanos, ayudará a ampliar nuestros conocimientos con impacto tanto para el ganado y el hombre. El modelo también puede ayudar a verificar que las opciones terapéuticas alternativas generalmente aceptados y para la eliminación de la pulmonar C. infecciones psittaci, que es, de nuevo, de interés tanto en medicina veterinaria y humana.

Técnicas aplicadas a muestras y obtenerse del Sistema Respiratorio Bovino

En este trabajo se describe e ilustra las técnicas y los métodos de diagnóstico Applicable para el pulmón bovino y utilizado en nuestro modelo para evaluar tanto los efectos del patógeno en el pulmón del mamífero y la eficacia de la intervención terapéutica.

La broncoscopia se ha realizado en la medicina humana desde la década de 1960 y se considera un procedimiento seguro 36. En terneros, broncoscopia experimental fue descrito en 1968 por primera vez 37. La aplicación intrabronquial de patógenos fue sugerido por Potgieter et al. Como un método fiable para producir la enfermedad del tracto respiratorio inferior en los terneros 38 y ahora es un método muy extendido en la investigación bovina 34,39,40. Intrabronquial inoculación de una cantidad definida del agente patógeno bajo control videoendoscópico permite la colocación selectiva del agente infeccioso en el pulmón. Esto lleva a los hallazgos clínicos y patológicos consistentes en todos los animales 34 y permite que los muestreos específicos de las regiones pulmonares que se espera que sean alterados debido a la exposición de patógenos.

<pclase = "jove_content"> fluido de lavado broncoalveolar (BALF) es un indicador bien descrito por la presencia y la gravedad de la inflamación pulmonar. El lavado broncoalveolar (BAL) es un procedimiento estándar en la medicina humana para el diagnóstico de una variedad de enfermedades respiratorias 41. En el ganado vivo, BAL fue introducido por Wilkie y Markham a finales de los años setenta del pasado siglo 42. Se consideró una técnica segura y repetible para estudiar el tracto respiratorio inferior de ganado. Debido a la falta de datos suficientes sobre los parámetros de BALF en animales sanos, en 1988 Pringle et al. Realizado BAL en terneros sanos con un broncoscopio flexible de fibra óptica. Los autores también señalaron la necesidad de estandarizar los protocolos de BAL en condiciones experimentales para adquirir resultados comparables 43. BAL todavía se utiliza como un método de muestreo in vivo en terneros 44-46.

Cepillado bronquial se utiliza comúnmente en la medicina humana como unherramienta de diagnóstico para probar las lesiones neoplásicas o para el análisis microbiológico 36. Para fines de investigación, los cultivos celulares primarios de células epiteliales cosechados por el cepillado citológico se pueden obtener 47. En el ganado, el uso de cepillado bronquial para el análisis microbiológico se ha descrito para caracterizar el medio ambiente microbiana del pulmón 43.

Biopsia pulmonar transbronquial ofrece muestras de tejido pulmonar y es una valiosa herramienta de diagnóstico para difundir enfermedades pulmonares en seres humanos. Neumotórax iatrogénico y hemorragia relacionada con el procedimiento son las complicaciones asociadas con esta técnica. Su incidencia es informado de que menos de uno por ciento en pacientes humanos 48. Biopsia pulmonar transbronquial no es un método común para el uso en el ganado vacuno, debido al alto coste del equipo requerido y el tiempo necesario para obtener biopsias. En lugar de ello, las biopsias de pulmón transcutáneos son más convenientes en condiciones de campo 49-51.

Protocol

Declaración de Ética Este estudio se llevó a cabo en estricto cumplimiento de la legislación europea y nacional para el Cuidado y Uso de Animales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la experimentación animal y la protección de los animales en el estado de Turingia, Alemania (Número de permiso: 04-004/11). Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo la supervisión del agente autorizado de la institución para la Protección de los Animales. La broncoscopia se realiza estrictamente bajo anestesia general. Durante el estudio, se hizo todo lo posible para minimizar el malestar o sufrimiento. Observaciones generales Las técnicas descritas se han desarrollado para los terneros de aproximadamente 6-8 semanas de edad, peso de alrededor de 60-80 kg. Para el uso en otra especie o terneros diferentes en edad y peso corporal de los animales grandes, las técnicas deben ser adaptados para ajustarse al tamaño y peso y tener en cuenta la anatomía pulmonar de la especie animal en particular. Todoequipo utilizado debe ser estéril. Chlamydia psittaci es una bacteria zoonótica que puede causar enfermedades respiratorias y en general en los seres humanos. El C. no aviar psittaci cepa DC15 utilizado en el presente protocolo debe ser manejado bajo nivel de bioseguridad 2. Todos los trabajos con el patógeno y con animales infectados se debe realizar usando equipo de protección personal, tales como un respirador, un traje a prueba de salpicaduras de agua, botas de goma y guantes. El uso de un respirador adecuado es de gran importancia, ya que el recorrido natural de la infección por C. psittaci es aerogen. Empaquetado y etiquetado de las muestras deben ser a prueba de desinfectante ya que todas las cosas deben ser tratados con un desinfectante eficaz contra clamidias de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de salir de la unidad de alojamiento de los animales. 1. Preparación del Animal de broncoscopia Determinar el peso de la pantorrilla para la dosificación de anestésicos. Coloque una vía intravenosa (IV) de acceso in la vena yugular izquierda. En primer lugar, inyectar lentamente xilazina (0.2 mg / kg de peso corporal) durante aproximadamente 30 segundos, a continuación, después de que ocurra la sedación, inyectar ketamina (2,0 mg / kg de peso corporal). Levante el animal sobre la mesa y lo coloca en decúbito lateral derecho. Una vez que el animal se coloca adecuadamente en la mesa, compruebe si el acceso intravenoso sigue en su lugar y reajustar si es necesario. Durante la anestesia, comprobar regularmente el reflejo palpebral para determinar la profundidad de la anestesia. Una vez que el animal está respirando de manera constante, que alguien tire de la lengua fuera y estirar el cuello. Coloque un espéculo tubo metálico en la boca del animal, mediante ligeros movimientos giratorios. Empuje el espéculo hacia adelante bajo el control de la vista, usando una linterna, hasta que la laringe es visible. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento endoscópico mediante la inyección de un bolo de 7 mg de xilazina y 70 mg de ketamina, según sea necesario. . 2 inoculación (puntos de inoculación: Figura 1) </p> Preparar 3 jeringas con inóculo, que contienen 1, 2, y 5 ml de inóculo. Inserte un tubo de teflón en el canal de trabajo del endoscopio. El tubo no debe sobresalir de la punta del endoscopio. Inserte el endoscopio a través del espéculo de metal. Reajustes leves del espéculo puede ser necesario para permitir el paso de la laringe. El bronquio traqueal, que se desvía a la derecha, ayuda a alinear la imagen en el monitor. Acople la jeringa con 5 ml de inóculo hasta el final del tubo de teflón. Navegar el tubo en las ramas donde se depositará el inóculo y aplicar la cantidad deseada (pulmón derecho: medius Lobus: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml y 1,0 ml; Pulmón izquierdo: craneal lobus, Pars craneal : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1.5 ml). Conecte la jeringa con 1 &# 160; ml de inóculo en el tubo, y luego navegar hasta las traqueal bronquios y depositar el inóculo (craneal lobus, Pars caudalis: 1.0 ml). Es útil para acercarse siempre las localizaciones en el mismo orden. Retire el endoscopio y el espéculo. Pulverizar 1 ml de inóculo en cada fosa nasal con un actuador. Traiga el animal de vuelta al establo y lo coloca en posición prona para despertarse. No dejar al animal sin supervisión o en compañía de otros animales hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. La recuperación debe ser estable de aire acondicionado, ya que la capacidad del animal para la termorregulación se reduce bajo anestesia general. NOTA: Los primeros signos clínicos deben ocurrir sobre 24-36 horas después de la inoculación, dependiendo del patógeno utilizado. . 3 Procedimientos de muestreo (Puntos de muestreo: Figura 2) Preparar el animal como se describe en los pasos 1.1 a 1.6. El lavado broncoalveolar Coloque 5 jeringas conteniendo cada uno 20 ml de solución salina isotónica estéril, en un baño de agua y permita que se calienten hasta aproximadamente 38 ° C. Insertar un catéter de lavado en el canal de trabajo del endoscopio, a continuación, insertar el endoscopio en el espéculo de metal y vaya hacia adelante en el bronquio principal del pulmón izquierdo hasta que se alcanza la posición de "cuña" en el que el endoscopio no puede ser empujado más lejos adelante. Uno tras otro, adjuntar las jeringas con la solución de NaCl caliente al catéter de lavado, infundir el líquido y aspirar directamente. El fluido de lavado broncoalveolar se debe almacenar en botellas de vidrio siliconizado y se puso en hielo inmediatamente después de la recuperación para evitar que los macrófagos alveolares se adhiera a la superficie del vidrio. Nota tanto la cantidad de solución salina infundido y la cantidad de fluido recuperado. Retire el catéter lavado del canal de trabajo. Cepillado bronquial Navegar por el endoscopio para la zona de muestreo deseada, en el protocolo descrito este es el Bifurcatio tráqueas. Cubra el pincel con el tubo antes de insertarla en el canal de trabajo del endoscopio hasta que la punta del pincel en el monitor. Empuje el cepillo con el tubo de plástico hacia adelante unos 5 cm y descubrir desde el tubo de plástico empujando el mango, a continuación, desplácese hasta la ubicación que va a ser cepillado. Frote llamadas epiteliales empujando y tirando con suavidad el cepillo hacia atrás y adelante mientras navega por el endoscopio para asegurar el contacto entre el cepillo y la pared del bronquio. Deje de roce cuando se produce hemorragia. Cubra el pincel con el tubo antes de sacarla del canal de trabajo. Prepara hasta cinco frotis en portaobjetos de microscopio rodando suavemente el pincel sobre la diapositiva. Fijar los frotis en metanol frío durante 10 minutos, el aire seco y almacenar a -20 ° C. El cepillo puede ser enjuagado endiversos medios de comunicación, en función de la finalidad de las células de la muestra. Si tomar múltiples cepillados en el mismo saco, asegúrese sólo para aclararlo en los medios de comunicación que no irrita la membrana mucosa. Biopsia pulmonar transbronquial Navegar por el endoscopio para la zona de muestreo deseada, en el protocolo descrito este es el caudalis Pars de los craneal lobus. Antes de colocar las pinzas de biopsia en el canal de trabajo abierto y cerrarlo un par de veces para asegurarse de que está funcionando sin problemas. Presione las pinzas de biopsia en la rama caudal del bronquio traqueal hasta que se produzca una ligera resistencia. Tire hacia atrás de 2-3 cm, abra la pinza, empuje hacia delante de unos 2 cm, cierre las pinzas, tire hacia atrás y retire la pinza del canal de trabajo. Esto requiere un poco de práctica. Retire con cuidado el tejido de los fórceps de biopsia con una aguja o pinzas pequeñas. Dependiendo de la utilización posterior de los tejidos, guárdelo en nitr líquidofibrinógeno o un medio de fijación adecuado. Esto debe suceder inmediatamente después de la extracción para evitar que los procesos autolíticos. Tratamiento post-procedimiento Traiga el animal de vuelta al establo y lo coloca en posición prona para despertarse. No dejar al animal sin supervisión o en compañía de otros animales hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. La recuperación debe ser estable de aire acondicionado, ya que la capacidad del animal para la termorregulación se reduce bajo anestesia general. Monitorear el animal para detectar signos de neumotórax para la próxima 24 horas. Suministrar alimentos y agua fresca cuando el animal ha recuperado la conciencia plena.

Representative Results

Curso de la Enfermedad El efecto del patógeno en la salud de los animales puede ser evaluada por el examen clínico. En nuestros modelos de infección en las vías respiratorias, los animales fueron examinados dos veces al día y las observaciones clínicas se registraron utilizando un sistema de puntuación. Información adicional fue capturado mediante la realización de otros métodos en vivo de muestreo, por ejemplo, la recogida de sangre y frotis o la medición de la función pulmonar. Exámenes patológicos se llevaron a cabo en diferentes puntos temporales después de la inoculación para describir el progreso de la infección 32-34. BALF Tasa de recuperación La tasa de recuperación del líquido infundido fue de 83,05 ± 4,58% (media ± DE). Detección de Patógenos Recultivo del patógeno se puede realizar a partir de cepillado bronquial. También, la selección por PCR de diferentes muestras es posible detectar el patógeno, por ejemplo, TIbiopsia ncidencia, muestra de pinceles citología, BALF células 52 o hisopado faríngeo. Visualización del patógeno es posible mediante la realización de inmunohistoquímica de secciones congeladas de las biopsias de pulmón y preparaciones de sedimentación de las células BALF (Figura 3). En experimentos anteriores, la PCR de muestras de sangre y los hisopos (conjuntival, fecal, nasales) se realizaron para caracterizar la propagación y derramamiento del agente patógeno 32. Los marcadores de la inflamación local en el tejido pulmonar En el BALF, diversos parámetros de la inflamación pulmonar pueden ser estudiados. El recuento total de células y la proporción de neutrófilos generalmente aumentan cuando la inflamación pulmonar está presente. Para la diferenciación de células, preparaciones de sedimentación de BALF células se pueden teñir de acuerdo con Giemsa y diferenciar mediante inmersión en aceite (Figura 4). Proporciones celulares y líquidos de la BALF se separan por centrifugación (300 xg; 20 min). El BALF-Sobrenadante contiene diversos marcadores que cambian durante los procesos inflamatorios en el pulmón y pueden estudiarse en condiciones experimentales. Ejemplos de ello son las proteínas totales y eicosanoides 29,34. Una visión general esquemática de la potencial uso adicional de las muestras descritas se muestra en la Figura 5. Figura 1. Esquema del pulmón bovino con sitios de inoculación (amarillo). Los números indican el orden en el que se administra el inóculo en los diferentes bronquios. R: right; L: izquierdo. Pulmón derecho: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 lobus caudalis: 0,5 ml y 1,0 ml 4; El pulmón izquierdo: craneal lobus, <strong> 5 Pars craneal: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 craneal lobus, Pars caudalis: 1.0 ml. . Figura 2 Esquema del pulmón bovino con puntos de inoculación (amarillo) y los sitios de muestreo:. Lavado broncoalveolar (azul), cepillado bronquial (verde) y la biopsia de pulmón (naranja) Tenga en cuenta que todas las muestras se obtuvieron a partir de las regiones donde se depositó el patógeno antes. R: derecho, L: izquierdo. Figura 3. A) La biopsia pulmonar a partir de un ternero inoculado con Chl psittaci amydia 4 días después de la inoculación (dpi), b) el sedimento celular de BALF de un ternero inoculó con C. psittaci 9 dpi. Etiquetado inmunohistoquímica para clamidias. Las inclusiones de clamidias (flechas) están presentes en el pulmón (a) y en los macrófagos alveolares (b). Counterstain hematoxilina. Figura 4. Sedimento celular de BALF de un ternero inoculados con C. psittaci 9 dpi. macrófagos alveolares (#) son el tipo celular predominante en el BALF. La cantidad de los granulocitos neutrófilos (*) aumenta cuando los procesos inflamatorios están presentes. Tinción Pappenheim Modificada. es.jpg "width =" 600 "/> Figura 5. Posibles métodos para la preparación de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Un método broncoscópica de la inoculación fue desarrollado diversos métodos de muestreo y de broncoscopia se adaptado para ser utilizado en animales grandes en condiciones experimentales. Las técnicas descritas son fáciles de aprender, incluso para los examinadores con poca experiencia en endoscopia. El proceso de la broncoscopia es mínimamente invasivo y sin efectos adversos asociados con los métodos de la inoculación, así como los métodos de muestreo descritos (BAL, biopsia pulmonar transbronquial, cepillado bronquial), fueron vistos nunca en ninguno de los animales. Las complicaciones asociadas a la biopsia pulmonar transbronquial en los seres humanos son la hemorragia y neumotórax 48, ninguno de ellos se observaron en los becerros que se sometieron a este procedimiento. La biopsia pulmonar transbronquial es más tiempo y requiere más equipo que el método transcutáneo, pero es menos invasiva y no asume el riesgo de infección de la herida.

El control visual, método endoscópico de inoculadosión permite la deposición de una cantidad definida de agente patógeno en sitios específicos del pulmón. Por lo tanto, resulta en hallazgos clínicos y patológicos muy consistentes en todos los animales inoculados 32-34. Sin embargo, no se parece a todas las características de la infección natural en los terneros. En un modelo de un C. respiratoria infección psittaci, la técnica descrita de la inoculación provocó lesiones pulmonares asociadas con los sitios de colocación de patógenos de 34 años, mientras que, en las infecciones adquiridas naturalmente terneros suelen desarrollar neumonía de los lóbulos apicales. Este hecho debe ser tenido en cuenta al interpretar la relevancia de los resultados experimentales en el contexto de las infecciones pulmonares adquiridas naturales en bovinos.

Videoendoscópico BAL permite el muestreo de un área definida del pulmón. Para fines experimentales, esto es una ventaja en comparación con el uso de un catéter nasal bajo condiciones ciegas. Debido a la anatomía del pulmón bovino, el catéter insertado a ciegas sería de empujeed para el lóbulo diafragmático derecho en la mayoría de los casos 53,54 y el examinador no tiene ninguna influencia en la zona del pulmón que se lavaged. Otra ventaja de la BAL endoscópica en terneros anestesiados en decúbito lateral es la alta tasa de recuperación media de fluido infundido de más de 80%. Una comparación con otros estudios revelan que, en pie, los terneros sedados, una recuperación de 133,3 ± 1,6 ml 46 y 127,13 ± 3,53 ml 45 después de la instilación de 240 ml de líquido en el lóbulo caudal se informó. En terneros sedados en decúbito esternal 51% del fluido infundido puede ser recuperado de la lóbulo craneal y 62% del lóbulo caudal 43. Esto significa que aproximadamente la mitad del fluido infundido podría ser recuperado en posición vertical de la pantorrilla. Dependiendo de la cantidad de BALF necesaria para su posterior preparación de la muestra, esto podría no dejar suficiente material para llevar a cabo todos los experimentos deseados. BAL en el ganado ha sido utilizado por muchos grupos de investigación y muchosdiferentes parámetros se han examinado en diversas condiciones. La mayoría de los autores realizaron el lavado de los lóbulos basales 43,45,46, pero la cantidad de líquido utilizado para el lavado difiere entre los grupos de investigación. Esto conduce a la falta de coherencia en la dilución de las células recuperadas, proteínas y otras sustancias, por lo que es difícil comparar los resultados de diferentes publicaciones. Por lo tanto, para el uso en el ganado vacuno se recomienda el lavado con cinco fracciones de 20 ml (es decir, 100 ml en total) cuerpo caliente solución salina, isotónica, que se recuperan inmediatamente después de la instilación. Cuando se utiliza un catéter de lavado con un diámetro grande (es decir> 2 mm), el volumen de cada fracción necesita ser aumentado ligeramente, dependiendo de la cantidad de líquido que permanecerá en el catéter.

La anatomía altamente segmentada del pulmón bovino conduce a una limitación metódica; los resultados obtenidos a partir de una parte del pulmón pueden no ser cierto para el resto del pulmón. Puesto que no estácontrol de visión de la zona pulmonar completo sondeado por biopsia transbronquial y lavado, el examinador no puede saber si las áreas muestreadas estaban sanos o enfermos. Por lo tanto, es muy importante probar ubicaciones donde el patógeno se inoculó antes con el fin de tener una mayor tasa de recuperación del patógeno y para tener una mayor posibilidad de muestreo de áreas pulmón enfermo. Otra limitación es el aumento del riesgo anestésico en los animales de la mala condición clínica. Los métodos descritos sólo deben utilizarse en modelos de enfermedad leve a moderada para mantener la carga de los animales tan bajas como sea posible. La anestesia general en los rumiantes deben mantenerse siempre lo más breve posible, ya que el desarrollo del gas en el rumen aumenta el riesgo anestésico en estas especies. Los animales deberán ser colocados en posición prona inmediatamente después de la broncoscopia para permitir que el flujo de salida del gas desarrollado y deben ser monitoreados de cerca hasta que estén completamente recuperados de la anestesia. También, las técnicas descritas no son Suitable para el muestreo de intervalos de menos de 24 horas.

El protocolo descrito se puede adaptar a otros agentes infecciosos. La inoculación endoscópica de diversos patógenos se ha descrito, tales como C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55 y bovina viral virus de la diarrea 44. Además, los sitios de depósito de patógenos en el pulmón pueden ser adaptados para el modelo deseado. Al elegir los sitios de muestreo, algunos hechos importantes tienen que ser tomadas en cuenta: sitios (i) El muestreo debe ser elegido sobre la base de la ubicación de la inoculación y en los hallazgos patológicos esperados. (Ii) Cuando la necropsia se va a realizar se debe tener cuidado de dejar suficientes áreas pulmonares no muestreadas para el muestreo ex vivo. (Iii) ubicación de los sitios de muestreo deben elegirse de modo que se puede llegar con el equipo. Especialmente para biopsia pulmonar transbronquial, hay limitaciones debido a la longitud de las pinzas de biopsia. (Iv) Tque el fin de la toma de muestras es importante, cepillado bronquial y biopsia pulmonar transbronquial podría llevar a un sangrado leve, que contaminaría el BALF. Por lo tanto, BALF siempre debe obtenerse primero. Cuando se utiliza el protocolo en otras especies, la anatomía de pulmón de especies específicas deben ser tenidas en cuenta.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors are very thankful to the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) of Germany for the funding of their work. Also, the authors thank Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel and all the other colleagues working in the team of the animal house (FLI, Germany) for their technical assistance with the bronchoscopies. They are very thankful to Maria-Christina Haase (FLI, Germany) for her help in providing literature. Furthermore, the authors wish to express their gratitude to Dr. Angela Berndt (FLI, Germany) and Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) for critical reading of the manuscript.

Materials

Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2,2 mm, working length 140 cm
lavage catheter  Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
acuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10  working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess  Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter 1.2 mm, length 43 mm
Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
metal tube speculum  n/a n/a diameter: 3.5 cm, length: 35 cm
flashlight n/a n/a
siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
inoculum n/a dilute pathogen in 8mL buffer
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References

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Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).
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