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Medicine

Die Bovine Lung in der biomedizinischen Forschung: Optisch Geführte Bronchoskopie, intrabronchial Inokulation und<em> In Vivo</em> Sampling-Techniken

Published: July 03, 2014
doi:
10.3791/51557
, , ,
1Institute of Molecular Pathogenesis,Friedrich-Loeffler-Institut

Summary

Dieser Artikel beschreibt bronchoskopischen Techniken in der Rinderlunge unter experimentellen Bedingungen, dh bronchoskopisch geführt Inokulation BAL-, Bronchial-Bürsten, und transbronchiale Lungenbiopsie.

Abstract

Es gibt eine laufende Suche nach alternativen Tiermodelle in der Forschung von Atemwegsmedizin. Je nach Ziel der Forschung, große Tiere als Modelle Lungenerkrankung ähneln oft die Situation des menschlichen Lungen viel besser als Mäuse. Arbeiten mit großen Tieren bietet auch die Möglichkeit, das gleiche Tier wiederholt über einen bestimmten Verlauf der Zeit, die langfristige Studien, ohne die Tiere zu können probieren.

Das Ziel war, in vivo Probenahmeverfahren für die Verwendung in einem Rinder Modell eines Atem Chlamydia psittaci-Infektion zu etablieren. Probenahme zu verschiedenen Zeitpunkten in jedem Tier während der Studie durchgeführt werden, und die Proben geeignet, die Wirtsreaktion, als auch die Erreger unter experimentellen Bedingungen zu studieren.

Bronchoskopie ist ein wertvolles diagnostisches Werkzeug in der Human-und Veterinärmedizin. Es ist eine sichere und minimal-invasive Verfahren. Diese article beschreibt die intrabronchial Impfung von Kälbern sowie Stichprobenverfahren für die unteren Atemwege. Videoendoscopic führt intrabronchial Inokulation bis sehr konsequent klinische und pathologische Befunde in allen geimpften Tiere und ist für den Einsatz in Modellen der infektiösen Lungenerkrankungen daher gut geeignet. Die beschriebenen Probenahmeverfahren sind BAL-, Bronchial-Bürsten und transbronchiale Lungenbiopsie. All dies sind wertvolle diagnostische Werkzeuge in der Humanmedizin und könnte zu Versuchszwecken an Kälber im Alter von 6-8 Wochen angepasst werden. Die erhaltenen Proben wurden sowohl für den Erregernachweis und Charakterisierung der Schwere der Lungenentzündung im Wirt.

Introduction

Die Werte von Großtiermodelle in der biomedizinischen Forschung

In der modernen interdisziplinären biomedizinischen Forschung sind Tiermodelle immer noch unverzichtbar, um komplexe Wechselwirkungen aufzuklären – für die Gesundheit oder einer Krankheitsstatus bezogen – in Säugetierorganismen. Trotz 17 Nobelpreise an Wissenschaftler, die Rinder, Pferde, Schafe, Geflügel oder als Modelle für die biomedizinische Forschung ein Studium verliehen wurde, sind heute die überwiegende Mehrheit der Tierversuche mit Nagetieren durchgeführt, während weniger als 1% der Studien sind mit Haustieren arbeiten oder Vieh.

Kleintiere bieten viele praktische Vorteile (dh niedrige Kosten, genetische Formbarkeit, hoher Durchsatz, Verfügbarkeit von zahlreichen genetischen und immunologischen Tools und Kits) und genetisch veränderte Mausmodelle werden in der Regel akzeptiert, um mechanistische Studien insbesondere zu entdecken molekularen Wege durchzuführen. In der biomedizinischen Forschung von komplexen Systemen, ter biologische Relevanz und klinische Nutzen von Mausmodellen wird immer mehr und mehr fraglich. Sie könnten irreführend sein und tragen das Risiko der Vereinfachung der biologischen Komplexität 2-9.

Aufgrund der Inter-Spezies-Eigenheiten, werden keine Einzeltierarten vollständig spiegeln die menschliche Situation, und die Verwendung von mehr als einem Modell scheint vorteilhaft in einem interdisziplinären biomedizinischen Forschungsansatz sein. Im Rahmen der translationalen Medizin, bieten große Tiere die Möglichkeit, als Vergleichsmodelle dienen, die Ergebnisse mit hoher biologischer Relevanz von Dual-Use für die menschliche und tierische Gesundheit ein. Bemerkenswert ist, das menschliche Genom ist stärker von der Rindergenoms als durch das Genom der Labornager ähnelte. Außerdem wurde kürzlich bestätigt, dass im Vergleich zu anderen Taxa ist das Genom von Mäusen wesentlich umge 10-12.

In einem komplexen Studiendesign, den Einsatz von Tieren bietet die unique Möglichkeit intraindividuelle langfristige Untersuchungen durch wiederholte Sammlung einer Vielzahl von Proben in vivo von ein-und-die-selben Individuum, ohne das Tier. Daher können funktionelle, entzündliche und morphologischen Veränderungen im gleichen Fach über einen bestimmten Zeitraum 13 überwacht werden.

Die Bovine Lung als geeignetes Atem Modell

Aufgrund der hohen Anzahl der signifikanten Unterschiede in der Lungenanatomie, Atemphysiologie und Lungen Immunologie, haben Mäuse nicht reproduzieren viele wichtige pathophysiologische Aspekte der menschlichen Lungenerkrankung. Dies ist bei der Verwendung als Tiermodelle von Atemwegserkrankungen 2,9,14-16 berücksichtigt werden. Obwohl Besonderheiten der Anatomie und Struktur nicht für jedes Säugetier-Lungen-existieren, sind funktionelle Eigenschaften (zB Lungenvolumen, Volumenströme und Atemmechanik) zwischen erwachsenen Menschen und Kälber aufgrund ähnlicher Körpergewicht besser vergleichbar(50-100 kg).

Die Spezies-spezifische Eigenschaften der Rinderlunge sind wie folgt zusammengefasst: die linke Lunge besteht aus zwei Lappen (Lobus cranialis, die in zwei Segmente unterteilt ist, und Lobus caudalis), während die rechte Lunge besteht aus vier Lappen (Lobus cranialis, Lobus medius, Lobus caudalis und Lobus accessorius). Im Gegensatz zu den Lungen Anatomie der meisten anderen Säugetieren, die Bronchien der rechten Hirnlappen Zweige direkt von der rechten seitlichen Seite der Luftröhre. In Bezug auf die Anatomie subgross präsentiert der Rinderlunge ein hohes Maß an Lobulierung und einen hohen Anteil an Zwischengewebe 17,18, die zu einem relativ geringen spezifischen Compliance der Lunge und eine höhere pulmonic Gewebewiderstand 19. Daher ist die erforderliche Atmungsaktivität ziemlich hoch im Vergleich zu anderen Spezies 20,21. Der hohe Grad der Unrundheit führt zu einer starken Unabhängigkeit der Segmente. So inflammatory Prozesse sind durch Bindegewebe Septen begrenzt und kranken und gesunden Segmente liegen oft innerhalb der gleichen Lappen. Aufgrund des Fehlens von Nebenluftwege ist der Rinderlunge besonders für obstruktive Lungenfunktionsstörungen 13 spiegeln. In Bezug auf das Gefäßsystem in der Rinderlunge, die kleinen Lungenarterien zeigen sehr prominente glatten Muskelschichten. Daher kann das Kalb auch als gut etablierten Tiermodell der pulmonalen Hypertonie oder vaskulären Umbau 22-24 dienen.

In Bezug auf Infektionen der Atemwege, existieren natürlich vorkommenden Krankheiten in Nutztieren, die viele Ähnlichkeiten mit dem vergleichbaren Krankheit im Menschen zu teilen. Typische Beispiele sind Rindertuberkulose 25, Respiratory-Syncytial-Virus (RSV)-Infektionen bei Kälbern 26-28 oder natürlich erworbenen Chlamydieninfektionen 29. So müssen Großtiermodellen sehr ähnlich der Situation in der natürlichen Wirt. Daher sind sie am meisten useful. für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen und die komplexe Pathophysiologie der entsprechenden Krankheit beim Menschen 30,31.

Als biologisch relevante Modell der Atem Chlamydia psittaci Infektion wurden gewählt, da Kälber Rinder darstellen natürlichen Wirte für diese Erreger 32-35. Informationen aus diesem Modell erhalten wird, in Bezug auf die Pathogenese der Erkrankung oder mögliche Übertragungswege zwischen Tier und Mensch, wird dazu beitragen, unser Wissen mit Auswirkungen für beide Vieh und Mensch zu erweitern. Das Modell kann auch helfen, allgemein anerkannte und alternative Therapiemöglichkeiten für die Beseitigung der Lungen C überprüfen psittaci-Infektionen, was wiederum von Interesse sowohl in der Veterinär-und Humanmedizin.

Und Techniken, um Proben, die aus den Bovine Respiratory System angewendet

Dieses Papier beschreibt und veranschaulicht die Techniken und Diagnoseverfahren applicable an der Rinderlunge und in unserem Modell verwendet, um sowohl die Auswirkungen des Erregers auf der Säugerlungen und die Wirksamkeit der therapeutischen Intervention zu evaluieren.

Bronchoskopie ist in der Humanmedizin seit den 1960er Jahren durchgeführt worden und gilt als ein sicheres Verfahren 36. Bei Kälbern wurde experimentell Bronchoskopie im Jahr 1968 zum ersten Mal 37 beschrieben. Die intrabronchial Anwendung von Krankheitserregern durch Potgieter et al. Als eine zuverlässige Methode, um Erkrankungen der unteren Atemwege bei 38 Kälbern zu produzieren und ist heute eine weit verbreitete Methode in Rinderforschungs 34,39,40. Intrabronchiale Inokulation einer definierten Menge des Pathogens unter videoendoskopischen Steuer eine selektive Plazierung des infektiösen Mittels in der Lunge. Dies führt zu konsistenten klinischen und pathologischen Befunde bei allen Tieren 34 und ermöglicht eine gezielte Entnahme von Lungenregionen, die erwartet, dass aufgrund der Erreger Belichtung verändert werden sollen.

<pclass = "jove_content"> bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist eine gut beschriebene Indikator für das Vorhandensein und die Schwere von Lungenentzündung. Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist ein Standardverfahren in der Humanmedizin für die Diagnose einer Vielzahl von Erkrankungen der Atemwege 41. In lebenden Rindern wurde BAL von Wilkie und Markham in den späten siebziger Jahren des letzten Jahrhunderts 42 eingeführt. Es wurde als eine sichere und reproduzierbare Technik, um die unteren Atemwege von Rindern zu studieren. Aufgrund des Mangels an ausreichenden Daten über BALF Parameter bei gesunden Tieren, 1988 Pringle et al. Geführt BAL auf gesunden Kälbern mit einem flexiblen fiberoptischen Bronchoskop. Die Autoren wiesen auch auf die Notwendigkeit, BAL-Protokolle unter experimentellen Bedingungen, um vergleichbare Ergebnisse zu standardisieren 43 erwerben. BAL ist immer noch als ein in vivo Probenahmeverfahren bei Kälbern 44-46 verwendet.

Bronchial Bürsten wird häufig in der Humanmedizin als verwendetDiagnose-Tool, um Neoplasien oder für die mikrobiologische Analyse 36 probieren. Für Forschungszwecke, können primäre Zellkulturen von Epithelzellen durch zytologische Bürsten 47 werden geerntet wurden. Bei Rindern ist die Verwendung von Bronchialausbürstungen zur mikrobiologischen Analyse beschrieben worden, um die mikrobielle Umgebung der Lunge 43 charakterisieren.

Transbronchiale Lungenbiopsie bietet Lungengewebeproben und ist ein wertvolles Diagnosewerkzeug für diffuse Lungenerkrankungen beim Menschen. Iatrogene Pneumothorax und Verfahren im Zusammenhang mit Blutungen sind Komplikationen, die mit dieser Technik verbunden. Ihre Häufigkeit wird berichtet, dass weniger als ein Prozent in menschlichen Patienten 48 ist. Transbronchiale Lungenbiopsie ist eine gängige Methode für die Anwendung bei Rindern, aufgrund der hohen Kosten für die Ausrüstung und die Zeit für die Biopsie zu erhalten. Stattdessen werden die transkutane Lungenbiopsien unter Feldbedingungen 49-51 bequemer.

Protocol

Ethikerklärung Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den europäischen und nationalen Rechtsvorschriften für die Pflege und Nutzung der Tiere durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche und Tierschutz in der Thüringen, Deutschland (: 04-004/11 Permit Number) genehmigt. Alle Experimente wurden unter Aufsicht des autorisierten institutionellen Agent für Tierschutz durchgeführt. Bronchoskopie wurde ausschließlich unter Vollnarkose durchgeführt. Während der Studie wurden alle Anstrengungen gemacht, um Beschwerden oder Leiden zu minimieren. Allgemeine Bemerkungen Die beschriebenen Techniken sind für Kälber von etwa 6-8 Wochen alt entwickelt worden, mit einem Gewicht von etwa 60-80 kg. Für die Verwendung in anderen Großtierarten oder Kälber in Alter und Körpergewicht unterschiedlich, müssen die Techniken angepasst, die Größe und Gewicht passen und berücksichtigen die Lungenanatomie der jeweiligen Tierarten werden. AlleGeräte verwendet werden, müssen steril sein. Chlamydia psittaci ist eine Zoonose-Bakterium, das Atem-und allgemeinen Krankheiten beim Menschen verursachen können. Die Nicht-Vogel C. psittaci DC15-Stamm in der vorliegenden Protokoll verwendet werden, müssen unter Sicherheitsstufe 2 gehandhabt werden. Alle Arbeiten mit dem Erreger und mit infizierten Tieren durchgeführt, muss das Tragen der persönlichen Schutzausrüstung, wie zum Beispiel ein Beatmungsgerät, eine spritzwassergeschützte Overall, Gummistiefel und Handschuhe. Das Tragen einer Atemschutz ist von großer Bedeutung, da die natürlichen Infektionsweg für C. psittaci ist aerogen. Verpackung und Kennzeichnung der Proben müssen Desinfektionssicher, da alle Dinge müssen mit einem Desinfektionsmittel wirksam gegen Chlamydien nach den Anweisungen des Herstellers vor dem Verlassen des Tierhaltungseinheit behandelt werden können. 1. Vorbereitung des Tier für Bronchoskopie Bestimmen Sie das Gewicht des Kalbes für die Dosierung von Anästhetika. Legen Sie eine intravenöse (IV) Zugang in die linke Halsschlagader. Zuerst langsam injizieren Xylazin (0,2 mg / kg Körpergewicht) über ca. 30 sec, dann, nach Sedierung auftritt, injizieren Ketamin (2,0 mg / kg Körpergewicht). Heben Sie das Tier auf den Tisch und legen Sie sie in der rechten Seitenlage. Sobald das Tier ausreichend auf dem Tisch positioniert ist, überprüfen, ob die IV-Zugang ist noch an Ort und nachjustieren, wenn nötig. Während der Narkose, regelmäßig die Augenlidreflex, um die Narkosetiefe zu bestimmen. Sobald das Tier ständig Atmung, jemanden ziehen Sie die Zunge heraus und strecken den Hals. Legen Sie ein Metallrohr Spekulum in das Maul des Tieres, mit leichten Drehbewegungen. Drücken Sie die Speculum vorne unter Sichtkontrolle, mit einer Taschenlampe, bis der Kehlkopf sichtbar ist. Aufrechterhaltung einer Narkose während des gesamten endoskopischen Verfahren durch Injektion eines Bolus von 7 mg Xylazin und 70 mg Ketamin nach Bedarf. . 2 Impfung (Impfung Seiten: Abbildung 1) </p> Vorbereitung 3 Spritzen mit Inokulum, das 1, 2, und 5 ml des Inokulums. Legen Sie eine Teflon-Schlauch in den Arbeitskanal des Endoskops. Das Rohr nicht aus der Spitze des Endoskops vorsteht. Legen Sie das Endoskop durch den Metalltrichter. Leichte Anpassungen des Speculum kann notwendig sein, um die Weitergabe des Kehlkopfes zu ermöglichen. Der Bronchus trachealis, die zweigt der rechten Seite, hilft, das Bild auf dem Monitor auszurichten. Die Spritze mit 5 ml Inokulum mit dem Ende des Teflonschlauchs. Navigieren Sie durch das Rohr in den Branchen, in denen der Impfstoff Urkunden werden und tragen Sie die gewünschte Menge (Rechte Lunge: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml und 1,0 ml; Linke Lunge: Lobus cranialis, Pars cranialis : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Befestigen Sie die Spritze mit 1 &# 160; ml Inokulum auf das Rohr, dann zu den Bronchus trachealis navigieren und hinterlegen das Inokulum (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Es ist hilfreich, immer in der gleichen Reihenfolge nähern sich den Lokalisierungen. Entfernen Sie das Endoskop und das Spekulum. Spray 1 ml des Inokulums in jedes Nasenloch mit einem Aktuator. Bringen Sie das Tier in den Stall zurück und legen Sie sie in Bauchlage für das Aufwachen. Das Tier unbeaufsichtigt oder in der Gesellschaft von anderen Tieren verlassen Sie nicht, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichende Brustlage zu halten. Die Erholung sollte stabil klimatisiert sein, da die Fähigkeit des Tieres zur Thermoregulierung wird unter Vollnarkose zurückgegangen. HINWEIS: Erste klinische Anzeichen sollte etwa 24-36 Stunden nach der Beimpfung auftreten, abhängig von dem Erreger verwendet. . 3 Stichprobenverfahren (Sampling Seiten: Abbildung 2) Bereiten Sie das Tier wie in Schritten von 1,1 bis 1,6 beschrieben. BAL Platz 5 Spritzen je 20 ml steriler isotonischer Kochsalzlösung, die in einem Wasserbad und lassen Sie sie bis zu ca. 38 ° C. Legen Sie eine Lavage Katheter in den Arbeitskanal des Endoskops, dann legen Sie das Endoskop in den Metalltrichter und navigieren Sie vorwärts in den Hauptbronchus der linken Lunge, bis der "Keil-Position" erreicht ist, wo das Endoskop nicht weiter vorangetrieben werden. Einer nach dem anderen, bringen Sie die Spritzen mit dem warmen NaCl-Lösung auf der Lavage-Katheter, die Flüssigkeit einzuflößen, und saugen Sie es direkt. Die BAL Flüssigkeit müssen silikonisierten Glasflaschen gespeichert und sofort auf Eis legen nach der Wiederherstellung, um die Alveolarmakrophagen von der Befestigung an der Glasoberfläche zu verhindern. Hinweis sowohl die Menge an Kochsalzlösung eingeträufelt und die Menge der zurückgewonnenen Flüssigkeit. Entfernen Sie die Spülung Katheter aus dem Arbeitskanal. Bronchial Bürsten Navigieren Sie durch das Endoskop auf die gewünschte Messstelle in der beschriebenen Protokoll die bifurcatio Tracheen. Decken Sie die Bürste mit dem Rohr vor dem Einsetzen in den Arbeitskanal des Endoskops bis Spitze des Pinsels auf dem Monitor erscheint. Schieben Sie die Bürste mit dem Kunststoffrohr vorn ca. 5 cm und entdecken Sie es aus dem Kunststoffrohr, indem Sie den Handgriff, und navigieren Sie zu dem Ort, die gebürstet werden soll. Reiben Sie epithelialen Anrufe durch leichtes Drücken und Ziehen Sie die Bürste hin und her, während der Navigation durch das Endoskop, um den Kontakt zwischen der Bürste und der Wand der Bronchien zu gewährleisten. Stoppen reiben, wenn Blutungen auftreten. Decken Sie die Bürste mit dem Rohr vor dem Herausziehen des Arbeitskanals. Bereiten Sie bis zu fünf Abstriche auf Objektträgern von sanften den Pinsel über die Folie. Fixieren Sie die Abstriche in kaltem Methanol für 10 min an der Luft trocknen und bei -20 ° C Die Bürste kann in abgespült werdenverschiedenen Medien, je nach dem Zweck der abgetasteten Zellen. Wenn unter mehreren Bürsten mit der gleichen Bürste, müssen Sie nur spülen Sie es in Medien, die die Schleimhaut zu reizen. Transbronchiale Lungenbiopsie Navigieren Sie durch das Endoskop auf die gewünschte Messstelle in der beschriebenen Protokoll die Pars caudalis Lobus cranialis der. Vor dem Einsetzen der Biopsiezange in den Arbeitskanal öffnen und schließen es ein paar Mal, um sicherzustellen, dass es reibungslos funktioniert. Schieben Sie die Biopsiezange in die Schwanz Zweig der Bronchus trachealis, bis ein leichter Widerstand auftritt. Zurückziehen 2-3 cm, öffnen Sie die Zange, voranzutreiben etwa 2 cm, schließen Sie die Zange, ziehen sich zurück und entfernen Sie die Zange aus dem Arbeitskanal. Dies erfordert etwas Übung. Das Gewebe vorsichtig aus der Biopsiezange, mit einer Nadel oder kleinen Zange. Abhängig von der weiteren Verwendung des Gewebes, speichern Sie es in flüssiger nitrogen oder einer geeigneten Fixierungsmedium. Dies sollte nach der Entfernung des autolytischen Prozesse verhindern Recht geschehen. Post-Verfahrensbehandlung Bringen Sie das Tier in den Stall zurück und legen Sie sie in Bauchlage für das Aufwachen. Das Tier unbeaufsichtigt oder in der Gesellschaft von anderen Tieren verlassen Sie nicht, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichende Brustlage zu halten. Die Erholung sollte stabil klimatisiert sein, da die Fähigkeit des Tieres zur Thermoregulierung wird unter Vollnarkose zurückgegangen. Überwachen Sie die Tier engmaschig auf Anzeichen eines Pneumothorax für die nächsten 24 Stunden. Geben Futter und frisches Wasser, wenn das Tier hat volle Bewusstsein wiedererlangt.

Representative Results

Krankheitsverlauf Die Wirkung des Pathogens auf die Gesundheit der Tiere kann durch klinische Untersuchung beurteilt. In unserer Ateminfektionsmodellen wurden die Tiere zweimal täglich untersucht und klinische Beobachtungen wurden mit Hilfe eines Scoring-System aufgezeichnet. Zusätzliche Informationen wurden mit der Durchführung anderer in-vivo-Probenahmemethoden, z. B. Gewinnung von Blut und Tupfer oder Lungenfunktionsmessung erfasst. Pathologische Untersuchungen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation durchgeführt, um den Fortschritt der Infektion 32-34 beschreiben. BALF Recovery Rate Die Wiederfindungsrate der Flüssigkeit eingeflößt war 83,05 ± 4,58% (Mittelwert ± SD). Nachweis von Krankheitserregern Rekultivierung des Erregers aus Bronchialausbürstungen durchgeführt werden. Auch PCR-Screening verschiedener Proben möglich, die Erreger zu erkennen, z. B. tiUSGABE Biopsie, Zytologie Bürste Probe BALF-Zellen 52 oder Rachenabstrich. Visualisierung des Pathogens ist, indem die Immunhistochemie von Gefrierschnitten der Lungenbiopsien und Sedimentation Zubereitungen der BALF-Zellen (Fig. 3) möglich. In früheren Experimenten, PCR von Blutproben und Abstriche (Bindehaut, fäkal, nasal) wurden durchgeführt, um die Ausbreitung zu charakterisieren und Ausscheidung des Erregers 32. Markierungen der lokalen Entzündung des Lungengewebes In der BALF können verschiedene Parameter der Lungenentzündung untersucht werden. Die Gesamtzellzahl und der Anteil der Neutrophilen in der Regel zu, wenn Lungenentzündung vorliegt. Für die Zelldifferenzierung, kann Sedimentation Zubereitungen der BALF-Zellen nach Giemsa gefärbt und differenziert mit Öl-Immersion (Abbildung 4) werden. Zelluläre und flüssige Anteile der BALF werden durch Zentrifugation (; 20 min 300 xg) getrennt. Die BALF-Überstand enthält verschiedene Marker, die bei Entzündungsprozessen in der Lunge verändern und unter experimentellen Bedingungen untersucht werden. Beispiele sind Gesamtprotein und Eicosanoide 29,34. Eine schematische Übersicht über die möglichen weiteren Verwendung der beschriebenen Proben sind in Fig. 5 gezeigt. Abbildung 1. Schema der Rinderlunge mit Beimpfungsstellen (gelb). Die Zahlen geben die Reihenfolge, in der der Impfstoff wird in den verschiedenen Bronchien verabreicht. R: right; L: links. Rechte Lunge: ein Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml und 1,0 ml 4; Linke Lunge: Lobus cranialis, <strong> 5 Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml. . Abbildung 2 Schema der Rinderlunge mit Beimpfungsstellen (gelb) und Probenahmestellen:. BAL (blau), Bronchial-Bürsten (grün), und Lungenbiopsie (orange) Beachten Sie, dass alle Proben aus Regionen, in denen der Erreger abgelagert erhalten zuvor. R: rechts, L: links. Abbildung 3. A) Lungenbiopsie von einem Kalb mit Chl geimpft amydia psittaci 4 Tage nach der Inokulation (dpi), b) Zellsediment BALF von einem Kalb mit C geimpft psittaci 9 dpi. Immunhistochemischen Markierung für Chlamydien. Chlamydien-Einschlüssen (Pfeile) vorhanden sind, in der Lunge (a) und in Alveolarmakrophagen (b). Hämatoxylin-Gegenfärbung. Abbildung 4. Cellular Sediment BALF von einem Kalb mit C geimpft psittaci 9 dpi. Alveolarmakrophagen (#) sind der vorherrschende Zelltyp in der BALF. Die Menge der neutrophilen Granulozyten (*) steigt, wenn entzündliche Prozesse vorhanden sind. Geändert Pappenheim. ES.jpg "width =" 600 "/> Abbildung 5. Mögliche Verfahren für die Probenvorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Ein bronchoskopischen Inokulierungsmethode entwickelt und wurden verschiedene bronchoskopischen Probenahmeverfahren geeignet ist, in großen Tieren unter experimentellen Bedingungen verwendet werden. Die beschriebenen Techniken sind einfach zu erlernen, auch für Prüfer mit wenig Erfahrung in der Endoskopie. Der Prozess der Bronchoskopie ist minimal invasiv und keine nachteiligen Wirkungen mit den Verfahren der Impfung sowie die beschriebenen Methoden zur Probenahme (BAL, transbronchiale Biopsie Lunge, Bronchien Bürsten) zugeordnet wurden je in einem der Tiere gesehen. Die mit transbronchiale Lungenbiopsien bei Menschen assoziierten Komplikationen sind Blutungen und Pneumothorax 48, keiner von ihnen wurden in den Waden, die dieses Verfahren unterzogen gesehen. Die transbronchiale Lungenbiopsie ist zeitaufwendig und erfordert mehr Ausrüstung als die transkutane Methode, aber es ist weniger invasiv und nicht das Risiko einer Wundinfektion zu tragen.

Die visuell kontrolliert, endoskopische Methode der impftIonen ermöglicht die Abscheidung einer definierten Menge Erreger an spezifischen Stellen der Lunge. So kommt es zu sehr konsequent klinische und pathologische Befunde in allen geimpften Tiere 32-34. Allerdings ist es nicht sämtliche Funktionen ähneln natürlichen Infektion bei Kälbern. In einem Modell eines Atem C. psittaci-Infektion, die beschriebene Technik der Impfung führte zur Lungenläsionen mit den Standorten der Erreger Platzierung 34 zugeordnet, während in natürlich erworbenen Infektionen Kälber entwickeln sich meist eine Lungenentzündung der Scheitellappen. Diese Tatsache muss bei der Interpretation die Relevanz der experimentellen Ergebnisse im Rahmen der natürlichen erworbenen Lungenentzündungen bei Rindern entnommen werden.

Videoendoscopic BAL ermöglicht Abtasten einer definierten Bereich der Lunge. Für experimentelle Zwecke ist ein Vorteil gegenüber der Verwendung eines Nasenkatheters unter Blindbedingungen. Aufgrund der Anatomie der Rinderlunge, würde die blind eingeführten Katheter zu schiebened rechts Zwerchfelllappen in den meisten Fällen 53,54 und der Prüfer hat keinen Einfluss auf den Bereich der Lunge, die ausgespült wird. Ein weiterer Vorteil der endoskopischen BAL bei narkotisierten Kälber in Seitenlage ist die hohe durchschnittliche Rückgewinnungsrate von Flüssigkeit eingeflößt von mehr als 80%. Ein Vergleich mit anderen Studien zeigt, dass, im Stehen, sediert Kälber, eine Erholung von 133,3 ± 1,6 ml und 46 ml 127,13 ± 3.53 45 nach Applikation von 240 ml Flüssigkeit in die Schwanzkeule ausgewiesen wird. In sediert Kälber in Brustlage 51% der Flüssigkeit eingeflößt könnte aus der Hirnlappen und 62% von der Schwanzkeule 43 zurückgewonnen werden. Dies bedeutet, dass etwa die Hälfte der Flüssigkeit tropft könnte in aufrechter Position des Kalbes gewonnen werden. Abhängig von der Menge der BALF für weitere Probenvorbereitung benötigt werden, könnte dies nicht genug Material zu verlassen, um die Durchführung aller gewünschten Experimenten. BAL bei Rindern wurde von vielen Forschungsgruppen verwendet wurden und vieleverschiedene Parameter unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Die meisten Autoren durchgeführt Lavage der basalen Lappen 43,45,46, aber die Menge der für die Spülung verwendete Flüssigkeit zwischen den Forschungsgruppen unterscheidet. Dies führt zu einer Inkonsistenz in Verdünnung der gewonnenen Zellen, Proteinen und anderen Substanzen, was es schwierig macht, die Ergebnisse aus verschiedenen Publikationen zu vergleichen. Daher wird für die Anwendung bei Rindern es Spülung mit fünf Fraktionen von 20 ml (dh insgesamt 100 ml) Körper warm, isotonische Kochsalzlösung, die unmittelbar nach der Instillation gewonnen werden empfohlen. Bei Verwendung einer Lavage-Katheter mit einem großen Durchmesser (dh> 2 mm), das Volumen jeder Fraktion muß leicht erhöht werden, abhängig von der Menge der Flüssigkeit, die in dem Katheter verbleibt.

Die stark segmentiert Anatomie des Rinderlunge führt zu einer methodischen Einschränkung; Ergebnisse von einem Teil der Lunge erhalten wird, kann nicht für den Rest der Lunge. Da es keinenSichtkontrolle der gesamten Lungenbereich durch transbronchiale Biopsie und Lavage sondiert, kann der Prüfer nicht, ob die abgetasteten Bereiche waren gesund oder krank. Daher ist es sehr wichtig, um Stellen, wo die Erreger vor, um eine höhere Wiedergewinnungsrate des Erregers zu haben und eine höhere Möglichkeit der Probenahme erkrankten Lungenbereiche haben inokuliert abzutasten. Eine weitere Einschränkung ist die erhöhte Narkoserisiko bei Tieren der schlechten klinischen Zustand. Die beschriebenen Methoden sollten nur in Modellen von leichter bis mittelschwerer Erkrankung, um die Belastung für die Tiere so gering wie möglich zu halten. Vollnarkose bei Wiederkäuern sollte immer so kurz wie möglich gehalten werden, da die Gasentwicklung im Pansen erhöht das Narkoserisiko bei diesen Arten. Die Tiere müssen in Bauchlage unmittelbar nach der Bronchoskopie, um den Abfluss des entwickelten Gas erlauben und muss genau beobachtet, bis sie vollständig aus der Narkose wiederhergestellt werden. Auch sind die beschriebenen Techniken nicht SuitaBLE für die Probenahme Abständen von weniger als 24 Stunden.

Das beschriebene Protokoll kann auf andere Infektionserreger angepasst werden. Endoskopische Inokulation verschiedener Pathogene beschrieben worden ist, wie C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55 und bovinen Virusdiarrhoe 44. Auch können die Stellen der Erreger Ablagerung in der Lunge zu dem gewünschten Modell angepasst werden. Bei der Auswahl der Messstellen, haben einige wichtige Fakten zu berücksichtigen: (i) Probenahmestellen sollten basierend auf den Standorten der Impfung und über die zu erwartenden pathologischen Befunde gewählt werden. (Ii) Bei der Obduktion durchgeführt Sorgfalt getroffen werden, um genug Unerprobte Lungenbereiche für Ex-vivo-Probenahme verlassen. (Iii) Sampling Standorte müssen so gewählt werden, so dass sie mit der Ausrüstung erreicht werden kann. Besonders für transbronchiale Lungenbiopsie, gibt es Einschränkungen aufgrund der Länge der Biopsiezange. (Iv) Ter, um der Probenahme ist wichtig, Bronchial-Bürsten und transbronchiale Lungenbiopsie kann zu leichten Blutungen führen, die die BALF kontaminieren würde. Daher müssen BALF immer zuerst erhalten werden. Wenn unter Verwendung des Protokolls in anderen Spezies, muss die artspezifischen Lungenanatomie zu berücksichtigen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors are very thankful to the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) of Germany for the funding of their work. Also, the authors thank Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel and all the other colleagues working in the team of the animal house (FLI, Germany) for their technical assistance with the bronchoscopies. They are very thankful to Maria-Christina Haase (FLI, Germany) for her help in providing literature. Furthermore, the authors wish to express their gratitude to Dr. Angela Berndt (FLI, Germany) and Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) for critical reading of the manuscript.

Materials

Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2,2 mm, working length 140 cm
lavage catheter  Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
acuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10  working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess  Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter 1.2 mm, length 43 mm
Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
metal tube speculum  n/a n/a diameter: 3.5 cm, length: 35 cm
flashlight n/a n/a
siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
inoculum n/a dilute pathogen in 8mL buffer
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References

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Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).
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