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Medicine

Il polmone bovino in ricerca biomedica: Visivamente guidata broncoscopia, intrabronchiale Semina ed<em> In Vivo</em> Tecniche di campionamento

Published: July 03, 2014
doi:
10.3791/51557
, , ,
1Institute of Molecular Pathogenesis,Friedrich-Loeffler-Institut

Summary

Questo articolo descrive le tecniche broncoscopiche nel polmone bovino in condizioni sperimentali, vale a dire l'inoculazione broncoscopicamente guidate, lavaggio broncoalveolare, spazzolatura bronchiale e biopsia transbronchiale.

Abstract

C'è una continua ricerca di modelli alternativi di animali nella ricerca della medicina respiratoria. A seconda del scopo della ricerca, grandi animali come modelli di malattia polmonare spesso assomigliano la situazione del polmone umano molto meglio di topi fanno. Lavorare con i grandi animali offre anche la possibilità di assaggiare lo stesso animale più volte nel corso di un determinato corso del tempo, che permette di studi a lungo termine senza sacrificare gli animali.

L'obiettivo era quello di stabilire in vivo metodi di campionamento per l'uso in un modello bovina di una infezione delle vie respiratorie Chlamydia psittaci. Il campionamento verrà effettuato in vari momenti in ciascun animale durante lo studio, e campioni dovrebbe essere adatto per studiare la risposta dell'ospite, così come il patogeno in condizioni sperimentali.

La broncoscopia è un valido strumento diagnostico in medicina umana e veterinaria. Si tratta di una procedura sicura e minimamente invasiva. Questo article descrive l'inoculazione intrabronchiale dei vitelli così come i metodi di campionamento per il tratto respiratorio inferiore. Videoendoscopic, inoculazione intrabronchiale porta a risultati clinici e patologici molto coerenti in tutti gli animali inoculati ed è, quindi, particolarmente adatto per l'uso in modelli di malattia polmonare infettiva. I metodi di campionamento descritti sono lavaggio broncoalveolare, spazzolatura bronchiale e biopsia transbronchiale. Tutti questi sono strumenti diagnostici importanti in medicina umana e potrebbe essere adattato a fini sperimentali per i vitelli di età compresa tra 6-8 settimane. I campioni ottenuti sono adatti sia per il rilevamento del patogeno e caratterizzazione della gravità di infiammazione polmonare nell'ospite.

Introduction

I valori di grandi modelli animali in Biomedical Research

Nella moderna ricerca biomedica interdisciplinare, i modelli animali sono ancora indispensabili per chiarire le interazioni complesse – relative alla salute o stato di malattia – all'interno di organismi mammiferi. Nonostante 17 premi Nobel aggiudicati agli scienziati che hanno studiato bovini, equini, ovini, pollame o come modelli per la ricerca biomedica 1, al giorno d'oggi la maggior parte degli esperimenti sugli animali sono intraprese con i roditori, mentre meno dell'1% degli studi stanno lavorando con gli animali domestici o bestiame.

Piccoli animali offrono molti vantaggi pratici (cioè a basso costo, malleabilità genetica, ad alto rendimento, disponibilità di numerosi genetica e strumenti immunologici e kit), e modelli murini geneticamente modificati sono generalmente accettate effettuare studi meccanicistici scoperta di particolari vie molecolari. Nella ricerca biomedica di sistemi complessi, tha rilevanza biologica e l'utilità clinica di modelli di topi sta diventando sempre più discutibile. Potrebbero essere fuorviante e sostenere il rischio di eccessiva semplificazione della complessità biologica 2-9.

Grazie alla peculiarità inter-specie, nessuna specie animale singolo sarà completamente rispecchiare la situazione umana, e l'uso di più di un modello sembra essere utile in un approccio di ricerca biomedica interdisciplinare. Nel contesto della medicina traslazionale, grandi animali offrono l'opportunità di servire come modelli comparativi fornire risultati di grande rilevanza biologica di prodotti a duplice uso per la salute sia umana che animale 1. Sorprendentemente, il genoma umano è più vicino a quello dal genoma bovino che dal genoma di roditori da laboratorio. Inoltre è stato confermato recentemente che, rispetto ad altri taxa, il genoma di topi è molto più riarrangiato 10-12.

In un disegno complesso studio, uso di bestiame offre la unique possibilità di intra-individuali, studi a lungo termine di ripetute raccolta di una varietà di campioni in vivo da uno-e-la-stessa individuum senza sacrificare l'animale. Pertanto, cambiamenti funzionali, infiammatorie e morfologiche possono essere monitorati nello stesso soggetto per un certo periodo di tempo 13.

Il polmone bovino come un modello adatto respiratoria

Dato l'elevato numero di differenze significative nel polmone anatomia, fisiologia respiratoria e immunologia polmonare, topi non riproducono molti importanti aspetti fisiopatologici della malattia polmonare umana. Questo deve essere preso in considerazione quando li utilizzano come modelli animali di malattie respiratorie 2,9,14-16. Anche se esistono peculiarità di anatomia e struttura per ogni polmone dei mammiferi, caratteristiche funzionali (cioè volumi polmonari, flussi d'aria e la meccanica respiratoria) sono meglio comparabili tra esseri umani adulti e vitelli a causa di pesi corporei simili(50-100 kg).

Le caratteristiche specie-specifiche del polmone bovino sono riassunti come segue: il polmone sinistro è costituita da due lobi (craniale lobus, che è diviso in due segmenti, e lobus caudalis), mentre il polmone destro si compone di quattro lobi (lobus craniale, lobus medius, lobus caudalis e lobus accessorius). A differenza del polmone anatomia della maggior parte degli altri mammiferi, bronco delle giuste rami lobi cranici direttamente dal lato laterale destro della trachea. Per quanto riguarda submacroscopica anatomia, polmone bovino presenta un alto grado di lobulazione e un'alta percentuale di tessuto interstiziale 17,18 portando ad una compliance relativamente bassa polmonare specifica e una maggiore resistenza del tessuto polmonare 19. Pertanto, l'attività di respirazione richiesto è piuttosto elevato rispetto ad altre specie 20,21. L'elevato grado di lobulazione porta ad una forte indipendenza dei segmenti. Così, infI processi lammatory sono limitate da setti di tessuto connettivo, e segmenti malati e sani, spesso si trovano all'interno dello stesso lobo. A causa della mancanza di vie collaterali, polmone bovino è particolarmente adatto per rispecchiare disfunzioni polmonari ostruttive 13. Per quanto riguarda il sistema vascolare nel polmone bovino, piccole arterie polmonari mostrano molto importanti strati muscolari lisce. Pertanto, il vitello può anche servire come un modello animale consolidata di ipertensione polmonare o vascolare rimodellamento 22-24.

Rispetto alle infezioni respiratorie, malattie esistono naturalmente nel bestiame che condividono molte similitudini con la malattia comparabile nell'uomo. Esempi tipici sono la tubercolosi bovina 25, virus respiratorio sinciziale (RSV), infezioni di vitelli 26-28, o infezioni da clamidia naturalmente acquisite 29. Così, i modelli animali di grandi dimensioni si assomigliano molto la situazione nell'ospite naturale. Pertanto, essi sono più useful per lo studio delle interazioni ospite-patogeno e la complessa fisiopatologia della malattia corrispondente di esseri umani 30,31.

Come modello biologicamente rilevanti di infezioni respiratorie Chlamydia psittaci, vitelli sono stati scelti in quanto rappresentano i bovini ospiti naturali per questo patogeno 32-35. Le informazioni ottenute da questo modello, rispetto alla patogenesi della malattia o possibili vie di trasmissione tra animali ed esseri umani, contribuirà ad ampliare la nostra conoscenza con un impatto sia per i bovini e uomo. Il modello può anche aiutare a verificare le opzioni terapeutiche alternative generalmente accettati e per l'eliminazione delle polmonare C. infezioni psittaci, che è, ancora una volta, di interesse sia in medicina umana e veterinaria.

Tecniche applicate da e campioni Disponibili dal sistema respiratorio Bovine

Questo articolo descrive ed illustra le tecniche ei metodi diagnostici applicable al polmone bovino e utilizzato nel nostro modello per valutare sia gli effetti del patogeno sul polmone di mammifero e l'efficacia dell'intervento terapeutico.

La broncoscopia è stata eseguita in medicina umana dal 1960 ed è considerata una procedura sicura 36. In vitelli, broncoscopia sperimentale è stato descritto nel 1968 per la prima volta 37. L'applicazione intrabronchiale di patogeni è stata suggerita da Potgieter et al. Come un metodo affidabile per produrre malattia del tratto respiratorio inferiore nei vitelli 38 e ora è un metodo diffuso nella ricerca bovina 34,39,40. Inoculazione endobronchiale di una quantità definita del patogeno sotto controllo videoendoscopic consente il posizionamento selettivo dell'agente infettivo nel polmone. Questo porta a risultati clinici e patologici coerenti in tutti gli animali 34 e permette di campionamento mirato delle regioni polmonari che si prevede essere alterato a causa di esposizione patogeno.

<pclass = "jove_content"> Lavaggio broncoalveolare fluido (BALF) è un indicatore ben descritto per la presenza e la gravità di infiammazione polmonare. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è una procedura standard in medicina umana per la diagnosi di una varietà di malattie respiratorie 41. Nei bovini vivi, BAL è stato introdotto da Wilkie e Markham negli anni settanta del secolo scorso 42. Si è ritenuto una tecnica sicura e ripetibile per studiare il tratto respiratorio inferiore del bestiame. A causa della mancanza di dati sufficienti sui parametri BALF in animali sani, nel 1988 Pringle et al. Eseguito BAL su vitelli sani con un broncoscopio flessibile a fibre ottiche. Gli autori hanno anche sottolineato la necessità di standardizzare i protocolli di BAL in condizioni sperimentali per acquisire risultati comparabili 43. BAL è ancora usato come un metodo di campionamento in vivo nei vitelli 44-46.

Spazzolatura bronchiale è comunemente usato nella medicina umana come unstrumento diagnostico per assaggiare lesioni neoplastiche o per l'analisi microbiologica 36. Per scopi di ricerca, colture cellulari primarie di cellule epiteliali raccolte mediante spazzolatura citologico possono essere ottenuti 47. Nei bovini, l'uso di brushings bronchiali per l'analisi microbiologica è stata descritta per caratterizzare l'ambiente microbico del polmone 43.

Biopsia transbronchiale polmonare fornisce campioni di tessuto polmonare ed è uno strumento diagnostico prezioso per diffondere malattie polmonari negli esseri umani. Pneumotorace iatrogeno ed emorragia correlata alla procedura sono complicazioni associate a questa tecnica. La loro incidenza è segnalato per essere meno di uno per cento in pazienti umani 48. Biopsia transbronchiale non è un metodo comune per l'uso nei bovini, a causa del costo elevato delle attrezzature necessarie e il tempo necessario per ottenere biopsie. Invece, biopsie polmonari transcutanea sono più convenienti in condizioni di campo 49-51.

Protocol

Dichiarazione Etica Questo studio è stato condotto in stretta conformità con la legge europea e nazionale per la cura e l'uso degli animali. Il protocollo è stato approvato dalla commissione etica della sperimentazione animale e la protezione degli animali nello Stato di Turingia, Germania (numero di permesso: 04-004/11). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti sotto la supervisione dell'agente istituzionale autorizzato per la protezione degli animali. La broncoscopia è rigorosamente eseguita in anestesia generale. Durante lo studio, è stato fatto ogni sforzo per ridurre al minimo il disagio o sofferenza. Osservazioni generali Sono state sviluppate le tecniche descritte per i vitelli di circa 6-8 settimane di età, del peso di circa 60-80 kg. Per l'uso in altre grandi specie o vitelli diverse per età e peso corporeo degli animali, le tecniche devono essere adattati per adattarsi alle dimensioni e il peso e prendere in considerazione l'anatomia del polmone delle particolari specie animali. Tuttoattrezzatura utilizzata deve essere sterile. Chlamydia psittaci è un batterio zoonosi che possono causare malattie respiratorie e generale nell'uomo. Il non-aviaria C. psittaci ceppo DC15 utilizzati nel presente protocollo deve essere gestita sotto il livello di biosicurezza 2. Tutti i lavori con l'agente patogeno e con animali infetti deve essere effettuata indossando dispositivi di protezione individuale, come un respiratore, una tuta a prova di spruzzi d'acqua, stivali di gomma e guanti. Indossare un respiratore adatto è di grande importanza, in quanto il percorso naturale di infezione di C. psittaci è Aerogen. Imballaggio ed etichettatura dei campioni devono essere a prova di disinfettanti poiché tutte le cose devono essere trattati con un efficace disinfettante contro chlamydiae secondo le istruzioni del produttore prima di lasciare l'unità abitativa animali. 1. Preparazione degli animali broncoscopia Determinare il peso del polpaccio per dosaggio di anestetici. Inserire un endovenosa (IV) accesso in la vena giugulare sinistra. Primo, iniettare lentamente xilazina (0,2 mg / kg di peso corporeo) in circa 30 sec, poi, dopo il verificarsi sedazione, iniettare ketamina (2,0 mg / kg di peso corporeo). Sollevare l'animale sul tavolo e metterlo in decubito laterale destro. Una volta che l'animale sia adeguatamente posizionato sul tavolo, controllare se l'accesso IV è ancora in vigore e regolare se necessario. Durante l'anestesia, controllare regolarmente il riflesso palpebrale per determinare la profondità dell'anestesia. Una volta che l'animale sta respirando costantemente, avere qualcuno tirare la lingua fuori e allungare il collo. Posizionare un speculum tubo metallico nella bocca dell'animale, utilizzando leggeri movimenti rotatori. Spingere la speculum in avanti sotto controllo la vista, utilizzando una torcia elettrica, fino a quando la laringe è visibile. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura endoscopica iniettando un bolo di 7 mg xilazina e 70 mg di ketamina come necessario. . 2 inoculazione (siti di inoculazione: Figura 1) </p> Preparare 3 siringhe con inoculo, contenenti 1, 2, e 5 ml di inoculo. Inserire un tubo in teflon nel canale di lavoro dell'endoscopio. Il tubo non deve sporgere dalla punta dell'endoscopio. Inserire l'endoscopio attraverso il speculum metal. Lievi ritocchi dei speculum potrebbero essere necessarie per consentire il passaggio della laringe. Il trachealis Bronco, che si stacca a destra, aiuta ad allineare l'immagine sul monitor. Attaccare la siringa con 5 ml di inoculo per la fine del tubo di Teflon. Passare il tubo nei rami in cui è depositato l'inoculo e applicare l'importo desiderato (polmone destro: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml e 1,0 ml; polmone sinistro: craniale lobus, Pars craniale : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1.5 ml). Attaccare la siringa con 1 &# 160; ml di inoculo per il tubo, poi passare ai trachealis Bronco e depositare l'inoculo (craniale lobus, Pars caudalis: 1.0 ml). È utile per avvicinarsi sempre le localizzazioni nello stesso ordine. Rimuovere l'endoscopio e lo speculum. Spray 1 ml di inoculo in ciascuna narice con un attuatore. Portare l'animale torna alla stalla e collocarlo in posizione prona per svegliarsi. Non lasciare l'animale incustodito o in compagnia di altri animali fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. La scuderia recupero deve essere climatizzato, dal momento che la capacità dell'animale per la termoregolazione è diminuita in anestesia generale. NOTA: Primi segni clinici dovrebbero essere circa 24-36 ore dopo l'inoculo, a seconda del patogeno utilizzato. . 3 procedure di campionamento (punti di campionamento: Figura 2) Preparare l'animale come descritto ai punti 1.1-1.6. Lavaggio broncoalveolare Mettere 5 siringhe contenenti ciascuna 20 ml di soluzione fisiologica isotonica sterile, in un bagnomaria e lasciare che raggiungano fino a circa 38 ° C. Inserire un catetere lavaggio nel canale di lavoro dell'endoscopio, quindi inserire l'endoscopio nella speculum metallo e navigare avanti nel bronco principale del polmone sinistro fino al raggiungimento della posizione "cuneo", dove l'endoscopio non può essere spinta ulteriormente avanti. Uno dopo l'altro, allegare le siringhe con la soluzione calda NaCl al catetere di lavaggio, infondere il liquido e aspirare direttamente. Il fluido di lavaggio broncoalveolare deve essere conservata in bottiglie di vetro siliconato e messo su ghiaccio subito dopo il ripristino di prevenire i macrofagi alveolari di attaccarsi alla superficie del vetro. Nota sia la quantità di soluzione salina instillato e la quantità di liquido recuperato. Rimuovere il catetere lavaggio dal canale di lavoro. Spazzolatura bronchiale Passare l'endoscopio nella posizione di campionamento desiderata, nel protocollo descritto questo è il Bifurcatio trachee. Coprire il pennello con il tubo prima di inserirlo nel canale di lavoro dell'endoscopio fino a quando la punta del pennello sul monitor. Spingere la spazzola con il tubo di plastica in avanti di circa 5 cm e scoprire dal tubo di plastica spingendo la maniglia, quindi passare alla posizione che è da spazzolare. Strofinare le chiamate epiteliali gentilmente spingendo e tirando il pennello avanti e indietro durante la navigazione l'endoscopio per assicurare il contatto tra il pennello e la parete del bronco. Smettere di sfregamento quando si verifica sanguinamento. Ricoprire la spazzola con il tubo prima di tirare fuori dal canale di lavoro. Preparare fino a cinque strisci su vetrini da microscopio facendo rotolare delicatamente il pennello sopra la diapositiva. Fissare gli strisci in metanolo freddo per 10 min, aria secca e conservare a -20 ° C. La spazzola può essere risciacquato invari mezzi, a seconda dello scopo delle cellule campionate. Se prendere più brushings con lo stesso pennello, assicuratevi di lavare solo in mezzi che non irrita la mucosa. Biopsia transbronchiale polmonare Passare l'endoscopio nella posizione di campionamento desiderata, nel protocollo descritto questo è il caudalis Pars dei craniale lobus. Prima di inserire le pinze da biopsia nel canale di lavoro aprire e chiudere un paio di volte per assicurarsi che funzioni senza intoppi. Spingere le pinze da biopsia nel ramo caudale del bronco trachealis finché non si verifica una leggera resistenza. Tirare indietro di 2-3 cm, aprire le pinze, spingere in avanti di circa 2 cm, chiudere le pinze, tirare indietro e rimuovere la pinza dal canale di lavoro. Questo richiede una certa pratica. Rimuovere con attenzione il tessuto dalle pinze da biopsia, utilizzando un ago o di piccole pinze. A seconda l'ulteriore uso del tessuto, conservarlo in nitr liquidoogen o un mezzo di fissazione adatto. Ciò dovrebbe avvenire subito dopo la rimozione per evitare processi autolitici. Trattamento post-procedurale Portare l'animale torna alla stalla e collocarlo in posizione prona per svegliarsi. Non lasciare l'animale incustodito o in compagnia di altri animali fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. La scuderia recupero deve essere climatizzato, dal momento che la capacità dell'animale per la termoregolazione è diminuita in anestesia generale. Monitorare l'animale attentamente per i segni di pneumotorace per la prossima 24 ore. Fornire mangimi e di acqua dolce quando l'animale ha riacquistato la piena consapevolezza.

Representative Results

Decorso della malattia L'effetto del patogeno sulla salute degli animali può essere valutato da un esame clinico. Nei nostri modelli di infezione delle vie respiratorie, gli animali sono stati esaminati due volte al giorno e osservazioni cliniche sono stati registrati utilizzando un sistema di punteggio. Ulteriori informazioni è stato catturato vivo eseguendo altri metodi di campionamento, ad esempio, la raccolta di sangue e tamponi o la misura della funzione polmonare. Esami patologici sono state effettuate a tempi diversi dopo l'inoculazione per descrivere il progresso dell'infezione 32-34. BALF tasso di recupero Il tasso di recupero del liquido instillato era 83,05 ± 4,58% (media ± SD). Rilevazione dei patogeni Ricoltivazione del patogeno può essere eseguita dal brushings bronchiali. Inoltre, PCR proiezione di vari campioni è possibile rilevare il patogeno, ad esempio TIbiopsia ssue, pennello campione citologia, BALF cellule 52 o faringea tampone. Visualizzazione del patogeno è possibile eseguendo immunoistochimica di sezioni congelate di biopsie polmonari e preparazioni sedimentazione delle BALF cellule (Figura 3). In precedenti esperimenti, PCR di campioni di sangue e tamponi (congiuntivale, fecale, nasali) sono stati eseguiti per caratterizzare la diffusione e spargimento del patogeno 32. Marcatori di infiammazione locale di tessuto polmonare Nel BALF, vari parametri di infiammazione polmonare possono essere studiate. La conta cellulare totale e la percentuale di neutrofili solito aumentano quando infiammazione polmonare è presente. Per la differenziazione cellulare, preparazioni sedimentazione di BALF-cellule possono essere colorate secondo Giemsa e differenziati utilizzando olio da immersione (Figura 4). Proporzioni cellulari e liquide del BALF sono separati mediante centrifugazione (300 xg, 20 min). Il BALF-Surnatante contiene vari marcatori che cambiano durante i processi infiammatori nel polmone e possono essere studiati in condizioni sperimentali. Esempi sono proteine ​​totali e eicosanoidi 29,34. Una panoramica schematica del potenziale ulteriore utilizzo dei campioni descritti è illustrato nella Figura 5. Figura 1. Schema del polmone bovini con siti di inoculazione (giallo). I numeri indicano l'ordine in cui l'inoculo viene somministrato nel differente bronchi. R: right; L: sinistra. Polmone destro: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 lobus caudalis: 0,5 ml e 4 1,0 ml; Polmone sinistro: craniale lobus, <strong> 5 Pars craniale: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1.5 ml, 8 craniale lobus, Pars caudalis: 1.0 ml. . Figura 2 Schema del polmone bovini con siti di inoculazione (giallo) e siti di campionamento:. Lavaggio broncoalveolare (blu), spazzolatura bronchiale (verde), e la biopsia polmonare (arancione) Si noti che tutti i campioni sono ottenuti da regioni in cui è stato depositato l'agente patogeno prima. R: destra, L: sinistra. Figura 3. A) Lung biopsia da un vitello inoculato con Chl amydia psittaci 4 giorni dopo l'inoculazione (dpi), b), sedimento cellulare di BALF da un vitello inoculato con C. psittaci 9 dpi. Etichettatura immunoistochimica per clamidie. Inclusioni clamidia (frecce) sono presenti nel polmone (a) e in macrofagi alveolari (b). Ematossilina di contrasto. Figura 4. Sedimento cellulare di BALF da un vitello inoculato con C. psittaci 9 dpi. macrofagi alveolari (#) sono il tipo cellulare predominante nella BALF. La quantità di granulociti neutrofili (*) aumenta in presenza di processi infiammatori. Modificato colorazione Pappenheim. ES.jpg "width =" 600 "/> Figura 5. Possibili metodi per la preparazione del campione. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Procedimento bronchoscopic di inoculazione è stato sviluppato e vari metodi di campionamento broncoscopici sono stati adattati per essere utilizzato in grandi animali in condizioni sperimentali. Le tecniche descritte sono facili da imparare, anche per esaminatori con poca esperienza in endoscopia. Il processo di broncoscopia è minimamente invasiva e senza effetti avversi associati con i metodi della inoculazione, così come i metodi di campionamento descritti (BAL, biopsia transbronchiale, spazzolatura bronchiale), sono stati mai visto in nessuno degli animali. Le complicanze associate alla biopsia transbronchiale negli esseri umani sono il sanguinamento e pneumotorace 48, nessuno di questi sono stati osservati nei vitelli che hanno subito questa procedura. La biopsia transbronchiale è più tempo e richiede apparecchiature più rispetto al metodo transcutaneo, ma è meno invasiva e non sopporta il rischio di infezione della ferita.

Il metodo endoscopico controllato visivamente di inoculatione permette la deposizione di una quantità definita di patogeno in siti specifici del polmone. Così, si traduce in risultati clinici e patologici molto coerenti in tutti gli animali inoculati 32-34. Tuttavia, non assomiglia tutte le funzionalità di infezione naturale nei vitelli. In un modello di C. respiratoria infezione psittaci, la tecnica descritta di inoculazione che hanno portato a lesioni polmonari associati con i siti di patogeno posizionamento 34, che, naturalmente le infezioni da vitelli solito sviluppare polmonite dei lobi apicali. Questo fatto deve essere preso in considerazione quando si interpretano la rilevanza dei risultati sperimentali nel contesto delle infezioni naturali polmonari acquisite in bovini.

Videoendoscopic BAL consente di campionare un'area definita del polmone. Ai fini sperimentali, questo è un vantaggio rispetto all'uso di un catetere nasale in cieco. A causa della anatomia del polmone bovino, il catetere inserito ciecamente sarebbe spintaed a destra lobo diaframma nella maggior parte dei casi 53,54 e l'esaminatore non ha alcuna influenza sulla zona del polmone che è lavaged. Un altro vantaggio del BAL endoscopica in vitelli anestetizzati in decubito laterale è l'elevato tasso medio di recupero del fluido instillato superiore a 80%. Un confronto con altri studi rivela che, in piedi, polpacci sedati, un recupero di 133,3 ± 1,6 ml 46 e 127,13 ± 3,53 ml 45 dopo l'instillazione di 240 ml di liquido nel lobo caudale viene segnalato. In vitelli sedati in decubito sternale il 51% del liquido instillato potrebbe essere recuperato dal lobo craniale e il 62% dal lobo caudale 43. Ciò significa che circa la metà del fluido instillato potrebbe essere recuperato in posizione eretta del polpaccio. A seconda della quantità di BALF indispensabile per ulteriori preparazione del campione, questo non potrebbe lasciare abbastanza materiale per effettuare tutti gli esperimenti desiderati. BAL nei bovini è stato utilizzato da molti gruppi di ricerca e moltidiversi parametri sono stati esaminati in diverse condizioni. La maggior parte degli autori hanno eseguito il lavaggio dei lobi basali 43,45,46, ma la quantità di fluido utilizzato per il lavaggio differisce tra i gruppi di ricerca. Questo porta ad incoerenza diluizione delle cellule recuperate, proteine ​​e altre sostanze, rendendo difficile per confrontare i risultati di diverse pubblicazioni. Pertanto, per l'impiego nei bovini è consigliabile il lavaggio con cinque frazioni da 20 ml (100 ml in totale) corpo caldo, salina isotonica, che vengono recuperati subito dopo l'instillazione. Quando si utilizza un catetere lavaggio con un diametro grande (cioè> 2 mm), il volume di ogni frazione deve essere leggermente aumentata, a seconda della quantità di fluido che rimarrà nel catetere.

L'anatomia altamente segmentata del polmone bovino porta ad una limitazione metodico; risultati ottenuti da una parte del polmone possono non essere vero per il resto del polmone. Poiché non vi ècontrollo visivo di tutta l'area del polmone sondato dalla biopsia transbronchiale e il lavaggio, l'esaminatore non può sapere se le aree campionate erano sani o malati. Pertanto, è molto importante per campionare luoghi in cui l'agente patogeno è stato inoculato prima in modo da avere un tasso di recupero superiore del patogeno e di avere una maggiore possibilità di campionamento aree polmone malato. Un altro limite è l'aumento del rischio anestetico negli animali di scarsa condizione clinica. I metodi descritti devono essere utilizzati solo in modelli di entità da lieve a moderata della malattia di mantenere l'onere per gli animali più basso possibile. L'anestesia generale nei ruminanti devono essere sempre tenuti il ​​più breve possibile, come lo sviluppo di gas nel rumine aumenta il rischio anestetico in queste specie. Gli animali devono essere collocati in posizione prona subito dopo la broncoscopia per consentire l'efflusso del gas sviluppato e devono essere strettamente monitorati fino a quando non sono completamente recuperati da anestesia. Inoltre, le tecniche descritte non sono SuitaBLE per il campionamento intervalli di meno di 24 ore.

Il protocollo descritto può essere adattato ad altri agenti infettivi. Inoculazione endoscopica di vari agenti patogeni è stato descritto, ad esempio C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, e della diarrea virale bovina 44. Inoltre, i siti di deposito patogeno nel polmone possono essere adattati al modello desiderato. Nella scelta dei siti di campionamento, alcuni fatti importanti devono essere prese in considerazione: un sito (i) campionamento devono essere scelti in base alle posizioni di inoculazione e sui risultati patologici attesi. (Ii) Quando necroscopia deve essere eseguita la cura deve essere presa a lasciare abbastanza aree polmonari di arresto al massimo per ex vivo campionamento. (Iii) l'ubicazione dei siti di campionamento devono essere scelti in modo che possano essere raggiunti con l'apparecchiatura. Soprattutto per biopsia transbronchiale, ci sono delle limitazioni dovute alla lunghezza delle pinze da biopsia. (Iv) Tegli ordine del campionamento è importante, spazzolatura bronchiale e biopsia transbronchiale potrebbero portare a sanguinamento minore, che avrebbe contaminare il BALF. Pertanto, BALF deve sempre essere ottenuta prima. Quando si utilizza il protocollo in altre specie, l'anatomia polmone specie-specifico deve essere preso in considerazione.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors are very thankful to the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) of Germany for the funding of their work. Also, the authors thank Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel and all the other colleagues working in the team of the animal house (FLI, Germany) for their technical assistance with the bronchoscopies. They are very thankful to Maria-Christina Haase (FLI, Germany) for her help in providing literature. Furthermore, the authors wish to express their gratitude to Dr. Angela Berndt (FLI, Germany) and Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) for critical reading of the manuscript.

Materials

Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2,2 mm, working length 140 cm
lavage catheter  Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
acuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10  working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
iv acess  Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter 1.2 mm, length 43 mm
Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
metal tube speculum  n/a n/a diameter: 3.5 cm, length: 35 cm
flashlight n/a n/a
siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
inoculum n/a dilute pathogen in 8mL buffer
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References

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Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).
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