Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Nota: Todos los parámetros que se indican en este protocolo son válidas para los instrumentos y modelos indicados aquí. Algunos de esos parámetros (marcadas con * en el texto) puede ser diferente si se utiliza otro fabricante o modelo. 1. Puesta en marcha de la FIB / SEM Monte el nanomanipulador fría hecha a la medida (NM) de punta sin asociar las trenzas de Cu a la anticontaminator (AC). En lugar asegurarse de que las trenzas están conectados al resto de la NM encima del punto de aislante para evitar la carga durante la etapa de afilado (1.2). Cierre la cámara de SEM, la bomba de alto vacío y la imagen de la punta NM. Si la punta es roma, doblados o contaminados por uso previo, afinarlo por medio del haz de iones: seleccionar patrones de fresado poligonales a lo largo de los lados de la punta, por lo que después de la molienda, la punta se estrechará hasta 1 mo menos. Una vez que los lados de la punta se han blanqueado de distancia, girar manualmente por 90 ° toda la varilla NMdesde fuera de la cámara de SEM. Ajuste las pautas de fresado poligonales para adaptarse a la punta girada y repetir la molienda desde un ángulo diferente. Una vez que la punta se ha agudizado a ser inferior a 1 micra, retraer el NM e inserte la aguja del Sistema de inyección de gas (GIS); cambiar la posición de la aguja para estar en alrededor de 1 mm por encima de la distancia de trabajo (en lugar de los habituales 175 micras). Si se utiliza un precursor Pt, cambiar su temperatura de funcionamiento de 24 a 26 ° C (en lugar de los habituales 40 º C). Estos pasos son necesarios para la crio-depósito 13 de la pinta. Abra la cámara de SEM y preparar la FIB / SEM para el modo crio montando el escenario muestra crio y el aire acondicionado. Cambie el NM a la posición insertada y conecte sus trenzas Cu a la AC. Asegúrese de no tocar accidentalmente la punta NM. El sistema se enfría con el NM insertado para asegurarse de que la pérdida de flexibilidad de la trenza de Cu a temperaturas criogénicas no obstaculizará el movimiento NMMent. Purgar los tubos para la refrigeración con gas nitrógeno seco durante unos minutos. Bombear la cámara de preparación de la crio y la cámara muestra principal a alto vacío. Añadir nitrógeno líquido para enfriar los Dewars ambas cámaras. Esperar hasta que se alcanza la temperatura deseada. 2. La congelación de la muestra Montar dos rejillas TEM para muestras FIB en el soporte de transferencia de SEM. Asegúrelos apretando los tornillos correspondientes con un destornillador. Montar una muestra de código auxiliar apropiado para la muestra y añadir una porción de la muestra. Dependiendo del tipo de sangre, las muestras pueden ser fijados con pegamento criogénico o con una abrazadera. Use cantidades tan pequeñas como sea posible para asegurar la congelación óptima. Monte el soporte de transferencia de SEM en el dispositivo de transferencia de vacío (ETV). Añadir nitrógeno líquido en la estación de antióxido y bombee hasta obtener aguanieve nitrógeno. Abra la slestación ushing y de inmersión congelar el titular de la transferencia SEM. Bomba de nuevo hasta que hierva se completa y se obtiene aguanieve nuevo. Cabe señalar que un etano o propano aguanieve o de congelación de alta presión son las técnicas más adecuadas para obtener la vitrificación de la muestra. Repliegue el titular de la transferencia SEM en la cámara de vacío de la ETV y sellarlo. Ventile la estación slushing y la esclusa de aire cámara de preparación de crio. Coincidir con el sello de ETV con la esclusa de aire de la cámara de preparación crio y la bomba. Cuando se alcanza un buen nivel de vacío, enganche el pasador de bolsa de aire para abrir el sello de la ETV y la esclusa de aire exterior; inserte el soporte de transferencia de SEM. Hay marcas en los cursores en las cámaras de preparación que indican la posición de la muestra para la farfulla y la fracturación. Si es necesario, la muestra puede ser: fracturó con el cuchillo frío; sublimado mediante el establecimiento de una temperatura más alta (por lo general -1006; C); recubiertos con Au / Pd o Pt por medio de la tartamudo frío (300 V, 10 mA, 60 seg para un 2-3 nm tapa de Au / Pd) *. Sublimación no debe utilizarse para las muestras vitrificados para evitar su recristalización. Utilice el cuchillo frío para abrir las tapas protectoras de las ranuras de rejilla TEM. Traiga la etapa de frío en el compartimento de medición a la altura de recepción (16 mm *). Apague el HT en el FIB / SEM y abra la esclusa de aire interior. Utilice la ETV para transferir el soporte de SEM en la cámara de muestra. Cómo atenuar la iluminación de la habitación puede ayudar en este paso. Una vez que el titular de la SEM se encuentra en la etapa de frío, desenganchar el VTD empujando y girando. Retirar la varilla de ETV hasta el final en la cámara de vacío VTD y cerrar la esclusa de aire interior, la esclusa de aire exterior y el sello de la ETV. La esclusa de aire exterior ahora se puede ventilar para retirar el sello ETV. No se requiere este último paso, pero se recomienda que la varilla ETV puede ser fácilmente desplazado por accidente, lo que puede causar dañosa la ETV o la esclusa. 3. Ion de fresado Encienda la alta tensión en ambas columnas y establecer los parámetros de imagen apropiadas (tensión de aceleración: 10 kV para el haz de electrones, 30 kV para el haz de iones; tamaño de punto: 3; distancia de trabajo: 5 mm, corriente de haz de iones: 10-100 pA para imágenes, 1-3 nA para fresado) *. Utilice el haz de electrones para encontrar una característica de interés y para adquirir imágenes para documentar el estado de la muestra antes de la extracción de la lámina. Una vez que una región de interés (ROI) para la extracción ha sido identificado, marcarlo por el patrón de haz de iones, a menos que la topografía de la muestra en sí permite una fácil identificación de la ROI, incluso después de la deposición de Pt. Para una mayor precisión, utilizar el método descrito por Pettersson et al. 14 Las marcas deben ser profunda, amplia y lo suficientemente lejos para ser todavía visibles después de ser cubierto por el depósito crio-Pt (que es no-SELectantes y cubrirá varios mm 2 de la superficie de la muestra). Calentar el gas precursor a 24-26 ° C e inserte la aguja GIS a una altura de aproximadamente 1 mm por encima de la superficie de la muestra (véase también el paso 1.3). Mientras que las imágenes con el haz de electrones, abrir la válvula de gas durante unos pocos segundos. La tasa de crio-Pt deposición es 100-500 nm / seg o más, dependiendo de la distancia de la aguja SIG, la rugosidad de la muestra y el sistema del usuario. Es recomendable ejecutar algunas declaraciones de prueba para determinar los parámetros óptimos. La prima deposición crio-Pt es muy áspero y no homogénea. Curar el depósito sobre el retorno de la inversión mediante el uso de un haz de iones 1000 pA a bajo aumento (por ejemplo 2000 X). A diferencia de la deposición crio, este sitio de curado es selectiva y se debe realizar en sólo el retorno de la inversión. El propósito de esta primera crio-deposición es para proteger la superficie de la muestra del daño haz de iones y para reducir curtaining durante adelgazamiento de iones 13. Incline la muestra a52 ° de manera que la superficie es perpendicular al haz de iones. Molino de distancia dos trincheras en terrazas en ambos lados de la ROI. Las dimensiones típicas de las trincheras son 20-30 micras en la dirección (X) paralela a la lamela a extraer, 10-15 micras en la dirección perpendicular (Y) y con una variable, pendiente de profundidad (Z), con el punto más profundo cerca de la ROI. La pendiente debe ser de 45-55 °. En algunos instrumentos, trincheras terrazas sólo se pueden moler con el punto más profundo en la parte superior. En tal caso, el molino de uno bajo el retorno de la inversión, a continuación, girar la imagen 180 º y molino de la segunda en el otro lado. La profundidad de fresado se puede seleccionar si se conoce la tasa de pulverización catódica del material. Para la mayoría de la muestra-hidratado congelado, la tasa de pulverización catódica de hielo se puede utilizar 7. Incline la muestra de nuevo a 0 ° y utilizar el haz de iones para cortar los lados y la parte inferior de la lámina, asegurándose de que las marcas de corte pasan por toda la lámina (deben dejar marcas de molienda en el molino de laderas en terrazased en el paso anterior). Deja sólo dos pequeños puentes que conectan la lámina para el resto de la muestra. Inserte la aguja GIS (esto puede variar ligeramente de la muestra). Maniobra el NM hasta que su punta está en contacto físico con la lámina, preferiblemente en el lado. Asegúrese de que el NM no obstruya la vista de haz de iones de los dos pequeños puentes que conectan. Abrir la válvula de SIG durante unos segundos y controlar la deposición de crio por imágenes continua con el haz de electrones. Cuando una capa de 1-2 micras adicional de Pt ha sido crio-depositado, cerrar la válvula. Curar el Pt (véase el paso 2.6) sólo en la pocas micras alrededor del punto donde el NM está en contacto con la lámina. Use una corriente de haz de iones de alta para cortar la lámina libre. Los dos puentes de conexión deben ser molidos de distancia, así como cualquier exceso de Pt que pueda haberse formado nuevos puntos de contacto entre la lámina y el resto de la muestra. No retraiga la aguja SIG todavía. </li> Maniobrar con cuidado el NM para extraer la lámina de las trincheras y moverlo lo menos 500 m por encima de la superficie de la muestra. Sólo después de este paso, retraer la aguja SIG. Baje la etapa de la muestra de unos pocos milímetros y muévalo hasta que una de las rejillas TEM está a la vista. Mueva el área de fijación en la parrilla en la posición de trabajo e introduzca la aguja SIG. Maniobrar con cuidado el NM para llevar la lámina adjunta en contacto físico con la zona de fijación en la rejilla TEM. No debe haber presión o tensión entre las láminas, la rejilla TEM y el NM. Abra la válvula de gas durante unos segundos y la crio-depósito de una capa de 1-2 micras adicional de Pt. Curar el Pt (véase el paso 2.6), sólo en pocas micras alrededor del punto de contacto entre la lámina y la rejilla TEM. Use una corriente de haz de iones de alta para cortar la lámina libre del NM. Esto se puede lograr mediante la molienda de distancia ya sea la punta NM o el lado de la muestra. En tél primer caso, la punta tendrá que ser afilada de nuevo antes del siguiente uso, como se describe en el paso 1.2. OPCIONAL: en esta etapa, es posible utilizar la ETV para tomar el soporte de transferencia de SEM y almacenarlo O / N en un Dewar lleno de nitrógeno líquido. Esta transferencia y el almacenamiento de O / N es probable que cause la formación de hielo en la superficie de la lámina si los cristales de hielo ya están presentes y / o si el nitrógeno líquido se expone al aire húmedo; pero este tipo de contaminación se eliminará por el siguiente paso en un tiempo relativamente corto. A medida que los pasos anteriores pueden haber tomado varias horas para completar, podría ser apropiado para hacerlo, ya que tras el paso siguiente no se recomienda dicho almacenamiento O / N, ya que no habría ninguna manera de eliminar la contaminación del hielo excepto por sublimación (que no se puede realizar si la vitrificación de la muestra debe ser mantenida). Incline la muestra a 52 ° y utilizar el haz de iones para diluir a la transparencia de electrones 7. Se recomienda comenzar con una mayor, rougsus corrientes de haz para eliminar la mayor y proceder al pulido fino de la superficie con corrientes de haz bajas, eventualmente también la reducción de la tensión de aceleración. El espesor final de la lámina debe ser de 100-200 nm o menos para el análisis en una ultraestructura TEM 100-200 kV o hasta 500 nm para la tomografía en un TEM 300 kV, dependiendo de la composición de la muestra. Durante el adelgazamiento, las tensiones internas de la muestra pueden provocar la lámina se enrolle o doblarse. En tal caso, la región adelgazada debe ser restringido. Esto sucedió por ejemplo en las Figuras 11 y 12. 4. Cryo Traslado al TEM Enjuague la estación de crio-transferencia con gas nitrógeno seco por un par de minutos. Añadir nitrógeno líquido para el Dewar de la TEM de CA y de la estación de crio-transferencia. Inserte el soporte de la crio-TEM de transferencia en la ranura correspondiente de la estación de la crio-transferencia y llenar su Dewar también. Espere hasta que cada borradoronent ha alcanzado la temperatura deseada (aproximadamente 15 min). Si es posible, el controlador del soporte de crio-TEM de transferencia debe ser conectado para controlar la temperatura durante la transferencia. Es importante darse cuenta de que la punta del soporte de TEM (donde se encuentra el sensor de temperatura) estará en contacto con la estación de transferencia de la crio-y por lo tanto se enfriará más rápidamente que el resto del soporte de TEM. Por ello se recomienda que el tiempo necesario para el conjunto del soporte TEM crio-transferencia para enfriarse se mide de antemano, y que se permite que el sistema para thermalize por lo menos esa cantidad de tiempo. Llene una taza criogénica con nitrógeno líquido y se sumerja en ella: la herramienta de TEM de la muestra de sujeción, un destornillador y unas pinzas, con el fin de enfriar sus consejos a la temperatura deseada. Todas las herramientas deben estar correctamente aislados en el otro extremo, para no causar quemaduras por frío a la mano del operador. Coincidir con el VTD a la esclusa de aire exterior. Traiga el ciervo fríocorreo a la altura de transferencia (16 mm *). Apague la alta tensión. Abra el sello ETV, la esclusa de aire exterior y la cámara de aire interior. Utilice la barra de ETV para bloquear en el soporte de transferencia SEM presionando y girando en sentido horario. Repliegue el titular de la transferencia SEM en la cámara de preparación crio. Utilice el cuchillo frío para cerrar las tapas de protección de las rejillas TEM. Esto es necesario para reducir la posible contaminación de hielo durante la transferencia. Utilice la varilla ETV para mover la muestra en la cámara de vacío de la ETV. Cierre las compuertas y el sello. Ventile la esclusa de aire exterior y retire la ETV. Coincidir con el VTD al puerto de SEM de la estación de la crio-transferencia. Mientras barrido con nitrógeno seco, use el pasador en la estación para abrir el sello de la ETV y deslice el soporte de transferencia de SEM en el Dewar de la estación de la crio-transferencia. Añadir suficiente nitrógeno líquido, de modo que el nivel en la estación de crio-transferencia es lo suficientemente altosimplemente sumergir la muestra. Utilice el destornillador previamente enfriada para abrir una de las tapas y aflojar el tornillo correspondiente que se mantiene la rejilla TEM en su lugar. Utilice las pinzas enfriada previamente a recoger la rejilla TEM y colocarlo en el soporte TEM. Utilice la hexring enfriado para sujetar la rejilla TEM en el soporte TEM. Cierre el obturador del soporte del crio-TEM transferencia. El paso de transferencia de la muestra es crucial y puede verse obstaculizado por gas nitrógeno reducir la visibilidad de la muestra pequeña de TEM. Desconectar la estación de crio-transferencia desde el sistema de bombeo y transportarlo cerca de la TEM, junto con el controlador de calentador del soporte de crio-TEM de transferencia. Arranque la bomba turbomolecular del TEM para bombear la línea de respaldo a la esclusa de aire TEM. Prepare el escenario muestra TEM a una inclinación de -70 ° *. Ajuste el tiempo de bombeo más corto para la esclusa de aire (30-60 seg), con sólo un ciclo de purga con gas nitrógeno seco. </li> Asegúrese de que el obturador de protección en el soporte de la crio-TEM traspasos está cerrado. Retire el soporte de TEM de la estación de la crio-transferencia y la inserta en el goniómetro inclinada (nitrógeno líquido se derrame fuera de la Dewar titular TEM). El ciclo de bombeo se iniciará. Una vez que se completa el ciclo, establecer el goniómetro para inclinar de nuevo a 0 ° y, al mismo tiempo, mantenga el soporte de TEM de modo que no gira con el goniómetro. Inserte completamente el interior del TEM. Durante este paso, el soporte de crio-TEM de transferencia debe estar conectado a su controlador de calentador para controlar la temperatura. El procedimiento para insertar el soporte de la muestra en el TEM puede variar entre diferentes TEM. Por ello se recomienda ponerse en contacto con el fabricante del TEM para obtener el procedimiento adecuado. Vuelva a llenar el titular de la crio-TEM transferencia Dewar. Espere a que el vacío en el TEM para llegar a un nivel aceptable.