Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Hinweis: Alle in diesem Protokoll angegebenen Parameter gelten für die Instrumente und Modelle hier angezeigt. Einige dieser Parameter (mit * im Text markiert) unterschiedlich sein können, wenn ein anderer Hersteller oder Modell verwendet wird. 1. Inbetriebnahme des FIB / SEM Montieren Sie die maßgeschneiderte Kälte Nanomanipulator (NM) Spitze ohne Befestigung der Cu Zöpfe an den anticontaminator (AC). Stattdessen stellen Sie sicher, die Zöpfe sind mit dem Rest der NM über der Dämmung Punkt, um Ladung während des Schärf Schritt (1.2) zu verhindern verbunden. Schließen Sie die SEM Kammer zu pumpen, um Hochvakuum-und Bild die NM Spitze. Wenn die Spitze ist stumpf, verbogen oder durch vorherigen Gebrauch verunreinigt, schleifen Sie es mit Hilfe des Ionenstrahls: Wählen Sie Polygon Fräsbilder entlang den Seiten der Spitze, so dass nach dem Fräsen wird die Spitze bis 1 um oder weniger nach unten verjüngen. Sobald die Seiten der Spitze haben weggefräst wurde, manuell um 90 ° drehen, den gesamten NM Stangevon außerhalb des REM-Kammer. Stellen Sie die polygonale Fräsbilder an die Spitze gedreht anpassen und wiederholen Fräsen aus einem anderen Blickwinkel. Sobald die Spitze wurde geschärft, um weniger als 1 um, einfahren NM und die Nadel des Gas Injection System (GIS); Neupositionierung der Nadel auf etwa 1 mm über der Arbeitsabstand (anstelle der üblichen 175 &mgr; m) sein. Bei Verwendung eines Pt-Vorläufer, ändern ihre Betriebstemperatur zu 24-26 ° C (anstatt der üblichen 40 ° C). Diese Schritte werden für Kryo-Abscheidung 13 der Pt erforderlich. Öffnen Sie die SEM Kammer und bereiten die FIB / SEM für Kryo-Modus durch die Montage des Kryo Probenbühne und der AC. Schalten Sie die NM auf der eingeschobenen Position und verbinden ihre Cu Zöpfe an den AC. Achten Sie darauf, nicht versehentlich berühren Sie die NM Spitze. Das System ist mit der NM eingesetzt, um sicherzustellen, dass der Verlust der Flexibilität der Cu-Geflecht bei kryogenen Temperaturen nicht die NM Bewegung behindern gekühltment. Spülen Sie die Rohrleitungen für die Kühlung mit trockenem Stickstoff für ein paar Minuten. Pumpen Sie den Kryo-Präparationskammer und der Hauptprobenkammer zu hohen Unterdruck. In flüssigem Stickstoff auf die Dewars, beide Kammern zu kühlen. Warten, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist. 2. Proben Freezing Montieren Sie zwei TEM-Grids für FIB-SEM-Proben auf der Überführungshalter. Sichere sie durch Anziehen der entsprechenden Schrauben mit einem Schraubendreher. Montieren Sie einen geeigneten Proben Stub für die Probe, und fügen Sie einen Teil der Probe. Abhängig von der Art der Probe kann die Probe mit kryogenen Klebstoff oder mit einer Klammer befestigt werden. Einsatzmengen so gering wie möglich, um eine optimale Einfrieren sicherzustellen. Montieren Sie den REM-Transfer Halter auf die Vakuumtransfervorrichtung (VTD). In flüssigem Stickstoff in die Auflösestation und abpumpen zu Stickstoff Schneematsch zu erhalten. Öffnen Sie die slushing Station und Tauch frieren die SEM Transfer Halter. Abpumpen wieder zum Kochen beendet ist und wieder Matsch erhalten wird. Es sei darauf hingewiesen, dass ein Ethan oder Propan-Slush-oder Hochdruckgefrier besser geeignet sind Techniken, um die Verglasung der Probe zu erhalten. Fahren Sie den REM-Transfer Halter in die Vakuumkammer des VTD und verschließen. Entlüften Sie die Auflösestation und der Kryo-Präparationskammer Luftschleuse. Passen Sie die VTD Dichtung mit der Luftschleuse der Kryo-Präparationskammer und Pumpe. Wenn eine gute Vakuumniveau erreicht ist, greifen in die Luftschleuse Stift, um das Siegel des VTD und der Außenluftschleuse zu öffnen; setzen Sie die SEM Transfer Halter. Es sind Markierungen auf der Schleifkontakte in den Kammern, die die Vorbereitung Probenposition für das Sputtern und Brechen. Wenn nötig, kann die Probe werden: gebrochen mit dem kalten Messer; durch Einstellung einer höheren Temperatur (in der Regel -100 sublimiert6, C); mit Au / Pd oder Pt durch die kalte Sprudler beschichtet (300 V, 10 mA, 60 sec für eine 2-3 nm Au / Pd-Cap) *. Sublimation sollte nicht für verglaste Proben verwendet werden, um ihre Rekristallisation zu vermeiden. Nutzen Sie die kalte Messer an der Schutzdeckel der TEM-Startplätze zu öffnen. Bringen Sie die Kältestufe in der Probenkammer auf die Empfangshöhe (16 mm *). Schalten Sie das HT auf dem FIB / SEM und öffnen Sie die Innenluftschleuse. Verwenden Sie die VTD, um die SEM Halter in die Probenkammer zu übertragen. Dimmen der Beleuchtung im Raum kann in diesem Schritt zu helfen. Sobald die SEM Halter in der Kältestufe, lösen Sie die VTD durch Drücken und Drehen. Fahren Sie den VTD Stange ganz in der VTD Vakuumkammer und schließen Sie die Innenluftschleuse, die Außenluftschleuse und der VTD-Dichtung. Die Außenluftschleuse kann nun entlüftet werden, um die VTD Dichtung zu entfernen. Dieser letzte Schritt ist nicht erforderlich, aber es wird empfohlen, da die VTD Stange kann leicht durch Unfall verdrängt werden, die Schäden verursachen könnenzu der VTD oder der Luftschleuse. 3. Ion Milling Schalten Sie die Hochspannung auf beiden Spalten und die entsprechenden Aufnahmeparameter (Beschleunigungsspannung: 10 kV für den Elektronenstrahl, 30 kV für den Ionenstrahl, Punktgröße: 3; Arbeitsabstand: 5 mm, Ionenstrahlstrom: 10-100 pA für Imaging, 1-3 nA für Fräsen) *. Verwenden des Elektronenstrahls, um ein Merkmal von Interesse zu finden und um Bilder zu erfassen, um den Status der Probe vor der Extraktion der Lamelle zu dokumentieren. Sobald ein interessierender Bereich (ROI) für die Extraktion identifiziert worden ist, zu kennzeichnen durch Ionenstrahlmuster, es sei denn, die Topographie der Probe selbst erlaubt eine einfache Identifizierung der ROI auch nach Pt-Abscheidung. Für erhöhte Präzision, verwenden Sie die von Pettersson et al. Beschriebenen Methode 14 Die Markierungen sollten tief, breit und weit genug noch sichtbar, nachdem er von der Kryo-Pt-Abscheidung (die nicht-sel ist bedeckt zu seinektive und wird mehrere mm 2 der Probenoberfläche zu bedecken). Erhitzen Sie das Vorläufergas auf 24-26 ° C und setzen Sie die GIS-Nadel bis zu einer Höhe von etwa 1 mm über der Oberfläche der Probe (siehe auch Schritt 1.3). Während die Abbildung mit dem Elektronenstrahl, öffnen Sie das Gasventil für ein paar Sekunden. Die Rate der Kryo-Pt Abscheidung 100-500 nm / sec oder mehr, abhängig von der Entfernung des GIS Nadel Probe Rauhigkeit und dem System des Benutzers. Es ist ratsam, ein paar Test Ablagerungen ausführen, um die optimalen Parameter zu bestimmen. Die rohe Kryo-Pt Ablagerung ist sehr rau und inhomogen. Cure die Anzahlung über die ROI mit Hilfe eines Ionenstrahls 1.000 pA bei geringer Vergrößerung (zB 2000 X). Im Gegensatz zu dem Kryo Abscheidung, ist das selektive Aushärten Ort und sollte nur auf der ROI durchgeführt werden. Der Zweck dieser ersten Kryo-Ablagerung, die Oberfläche der Probe von Ionenstrahlschäden zu schützen und Schleier während Ionendünnung 13 zu reduzieren. Kippen Sie die Probe auf52 °, so dass die Fläche senkrecht zum Ionenstrahl ist. Mühle entfernt zwei Reihen Gräben auf beiden Seite der ROI. Typische Abmessungen für die Gräben 20-30 &mgr; m in der Richtung (X) parallel zu den Lamellen zu extrahieren, 10-15 um in der senkrechten Richtung (Y) und mit einem variablen, abfallenden Tiefe (Z), wobei der tiefste Punkt zu schließen, um den ROI. Die Steigung sollte 45-55 ° betragen. Bei einigen Geräten kann Reihen Gräben nur mit dem tiefsten Punkt auf der Oberseite gefräst werden. In einem solchen Fall unter der Mühle ein ROI, und drehen Sie das Bild um 180 ° und Mühle die zweite auf der anderen Seite. Die Frästiefe kann ausgewählt werden, wenn die Sputterrate des Materials bekannt ist. Für die meisten tiefgefrorenen Probe kann der Sputter-Rate von Eis verwendet werden 7. Kippen Sie die Probe auf 0 ° und benutzen den Ionenstrahl zu schneiden weg die Seiten und die Unterseite der Lamelle, so dass die Schnittmarken durch die gesamte Lamellen gehen (sie sollten Fräs-Markierungen auf dem terrassierten Hängen Mühle verlassenim vorherigen Schritt ed). Lassen Sie nur zwei kleine Brücken verbinden die Lamelle mit dem Rest der Probe. Legen Sie die GIS-Nadel (dies kann leicht verschieben die Probe). Manövrieren des NM, bis seine Spitze in physikalischem Kontakt mit der Lamelle, vorzugsweise auf der Seite. Sicherstellen, dass der NM nicht behindern den Ionenstrahl Ansicht der zwei kleine Verbindungsbrücken. Öffnen Sie die GIS Ventil für ein paar Sekunden und Überwachung der Kryo Abscheidung von kontinuierlichen Bilderzeugung mit dem Elektronenstrahl. Wenn eine zusätzliche Schicht von 1-2 um Pt wurde Kryo dampft, das Ventil zu schließen. Härten des Pt (siehe Schritt 2.6) nur in den wenigen &mgr; m um den Punkt, wo die NM in Kontakt mit der Lamelle. Verwenden Sie eine hohe Ionenstrahlstrom, um die Lamellen frei geschnitten. Die beiden Verbindungsbrücken sollten entfernt überschüssiges Pt, die neue Kontaktpunkte zwischen der Lamelle und dem Rest der Probe gebildet haben können gemahlen und werden. Sie noch nicht die GIS Nadel zurückzuziehen. </li> Vorsichtig manövrieren die NM, die Lamellen aus den Schützengräben zu extrahieren und verschieben Sie es mindestens 500 um über der Probenoberfläche. Erst nach diesem Schritt einfahren GIS Nadel. Senken Sie den Probentisch ein paar mm und verschieben Sie sie, bis einer der TEM-Gitter ist in Sicht. Bewegen Sie den Befestigungsbereich auf dem Gitter in die Arbeitsposition und legen Sie die GIS-Nadel. Vorsichtig manövrieren die NM um die angehängte Lamellen in physischen Kontakt mit dem Befestigungsbereich auf der TEM-Gitter zu bringen. Es sollte kein Druck oder Spannung zwischen den Lamellen, der TEM-Gitter und der NM sein. Öffnen Sie das Gasventil für ein paar Sekunden, und Kryo-Lagerstätte eine zusätzliche Schicht von 1-2 um Pt. Heilt Pt (siehe Schritt 2.6) nur in der wenigen um rund um den Berührungspunkt zwischen den Lamellen und dem TEM-Gitter. Verwenden Sie eine hohe Ionenstrahlstrom, um die Lamellen frei von der NM geschnitten. Dies kann durch Mahlen entfernt entweder die NM Spitze oder die Seite der Probe durchgeführt werden. In ter ersten Fall wird die Spitze noch einmal vor der nächsten Verwendung geschärft werden, wie in Schritt 1.2 beschrieben. OPTIONAL: zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, die VTD verwenden, um die SEM-Transfer Halter nehmen und speichern es O / N in einem Dewar mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Diese Übertragung und O / N Speicher wahrscheinlich die Bildung von Eis auf der Oberfläche der Lamelle verursachen Eiskristalle bereits vorhanden sind und / oder wenn der flüssige Stickstoff feuchter Luft ausgesetzt wird; aber solche Verunreinigung wird durch die nächste Stufe in einer relativ kurzen Zeit entfernt werden. Wie die vorherigen Schritte kann mehrere Stunden in Anspruch genommen haben, ist es angebracht sein könnte, dies zu tun, denn nach dem folgenden Schritt solche Speicher O / N wird nicht empfohlen, da gäbe es keine Möglichkeit, um das Eis Kontamination außer durch Sublimation zu entfernen (was sein kann nicht ausgeführt werden, wenn die Verglasung der Probe aufrechterhalten werden). Kippen Sie die Probe auf 52 ° und benutzen den Ionenstrahl zu dünn ist, um die Transparenz 7 Elektronen. Es wird empfohlen, mit höheren, roug startenihre Strahlströmen, den Groß entfernen und gehen Sie zur Fein Polieren der Oberfläche mit geringerer Strahlströme, eventuell auch die Verringerung der Beschleunigungsspannung. Die endgültige Dicke der Lamelle ist 100-200 nm oder weniger für die Analyse in einem Ultra 100-200 kV TEM oder bis zu 500 nm für die Tomographie in einem 300-kV-TEM, abhängig von der Probenzusammensetzung. Während Verdünnung können die inneren Spannungen der Probe bewirken, dass die Lamelle zu kuscheln oder sich verbiegen. In einem solchen Fall sollte der Bereich dünner beschränkt. Dies passiert beispielsweise in den Fig. 11 und 12. 4. Cryo TEM-Transfer Spülen Sie die Kryo-Übergabestation mit trockenem Stickstoff für ein paar Minuten. In flüssigem Stickstoff auf die Dewar der TEM-AC und der Kryo-Übergabestation. Legen Sie die Kryo-TEM-Transfer Halter in den entsprechenden Steckplatz des Kryo-Übergabestation und füllen ihre Dewar als gut. Warten Sie, bis jedes Layoutonent die gewünschte Temperatur (ca. 15 min) erreicht hat. Wenn möglich, sollte die Steuerung des Cryo-TEM-Übertragungshalterung, die Temperatur während der Übertragung Monitor angeschlossen werden. Es ist wichtig zu erkennen, dass die Spitze des TEM-Aufnahme (wo der Temperatursensor angeordnet ist) wird in Kontakt mit dem Kryo-Übergabestation und wird daher viel schneller abkühlen als der Rest der TEM Halter. Es wird daher empfohlen, dass die Zeit für die ganze Kryo-TEM-Transfer Halter zum Abkühlen benötigt wird vorher gemessen, und dass das System erlaubt, für mindestens diese Zeit thermalisieren. Füllen Sie eine Tasse mit kryogenen flüssigen Stickstoff und tauchen in ihm: die TEM-Probenspannwerkzeug, einen Schraubendreher und Pinzette, um ihre Tipps, um die gewünschte Temperatur abkühlen. Alle Werkzeuge werden richtig am anderen Ende isoliert sein, um nicht zu kalt Verbrennungen der Hand des Bedieners führen. Passen Sie die VTD auf die Außenluftschleuse. Bringen Sie den kalten Hirsche in die Übergabehöhe (16 mm *). Schalten Sie die Hochspannung. Öffnen Sie die VTD-Dichtung, die Außenluftschleuse und der Innenluftschleuse. Verwenden Sie die VTD Stange in die SEM-Transfer Halter durch Drücken und Drehen im Uhrzeigersinn verriegeln. Fahren Sie den REM-Transfer Halter in die Kryo-Präparationskammer. Nutzen Sie die kalte Messer an der Schutzdeckel der TEM-Gitter schließen. Dies ist notwendig, um mögliche Verunreinigungen Eis während der Übertragung zu verringern. Verwenden Sie die VTD Stange, um die Probe in die Vakuumkammer des VTD zu bewegen. Schließen Sie die Luftschleusen und Siegel. Entlüften Sie die Außenluftschleuse und nehmen Sie die VTD. Passen Sie die VTD dem SEM-Port des Kryo-Übergabestation. Während Spülen mit trockenem Stickstoff, verwenden Sie den Pin auf der Station, um das Siegel des VTD öffnen und schieben Sie die SEM Transfer Halter in den Dewar der Kryo-Übergabestation. Fügen Sie genug von flüssigem Stickstoff, so dass das Niveau in der Kryo-Übergabestation ist hoch genug,um nur die Probe eintauchen. Mit dem zuvor gekühlt Schraubendreher, um einer der Deckel öffnen und die entsprechende Schraube lösen, dass die Beibehaltung der TEM-Gitter an Ort und Stelle. Verwenden Sie die zuvor gekühlt Pinzette, um die TEM-Gitter holen und es in der TEM-Halter. Verwenden Sie die hexring gekühlt, um die TEM-Gitter auf der TEM-Halter zu befestigen. Schließen des Verschlusses des Cryo-TEM-Übertragungshalter. Die Probenübertragungsschritt ist entscheidend und kann durch Stickstoffgas behindert die Verringerung der Sichtbarkeit der kleinen TEM Probe. Trennen Sie das Kryo-Übergabestation aus dem Pumpsystem und transportieren sie in der Nähe des TEM, zusammen mit der Heizungssteuerung der Kryo-TEM-Transfer Halter. Starten der Turbomolekularpumpe der TEM, um die Trägerleitung zu dem TEM Schleusen pumpen. Stellen Sie die TEM Probenbühne zu einer Neigung von -70 ° *. Gesetzt den kürzesten Pumpzeit für die Luftschleuse (30-60 sec), mit nur einem Zyklus von Spülen mit trockenem Stickstoffgas. </li> Stellen Sie sicher, dass die Schutzklappe an der Kryo-TEM-Transfer Halter ist geschlossen. Entfernen Sie die TEM Halter aus dem Kryo-Übergabestation und legen Sie sie in der gekippten Goniometer (flüssiger Stickstoff wird aus der TEM Halter Dewar verschütten). Der Pumpzyklus beginnt. Sobald der Zyklus beendet ist, stellen Sie den Winkelmesser auf 0 ° nach hinten neigen und in der gleichen Zeit, halten Sie den TEM-Halter, so dass es nicht mit dem Goniometer drehen. Setzen Sie ihn ganz in der TEM. Bei diesem Schritt sollte der Kryo-TEM-Übertragungshalter seine Heizungssteuerung verbunden sein, um die Temperatur zu überwachen. Das Verfahren, um den Probenhalter in die TEM einfügen kann zwischen verschiedenen TEMs variieren. Es wird daher empfohlen, die TEM-Hersteller wenden, um die entsprechenden Verfahren zu erhalten. Füllen Sie den Cryo-TEM-Transfer Halter Dewar. Warten, bis das Vakuum in der TEM einen akzeptablen Level zu erreichen.