集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

注：このプロトコルで指定されたすべてのパラメータは、ここに示されている楽器やモデルに有効です。他のメーカーやモデルが使用されている場合（本文中に*でマーク）これらのパラメータの一部が異なる場合があります。 FIB / SEMの1。スタートアップ anticontaminator（AC）に銅編組を結び付けずに、特注の冷たいナノマニピュレータ（NM）チップをマウントします。代わりに三つ編みが先鋭化ステップ（1.2）中に電荷を防止するための絶縁点以上のNMの残りの部分に接続されていることを確認してください。 高真空と画像のNM先端にポンプ、SEMチャンバーを閉じます。 先端は、鈍曲がったり、前の使用によって汚染されている場合には、イオンビームを用いて削り：先端部の側面に沿って、多角形フライスパターンを選択し、粉砕後、先端が1μm以下にまで先細りになるようにします。 先端の辺が離れてミリングされたら、手動で全体NMロッド90°だけ回転SEM室の外から。 別の角度から回転先端を繰り返しフライス加工に適応するために、多角形フライスパターンを調整します。 先端は、1ミクロン未満であるNMを後退させるとガス注入システム（GIS）の針を挿入するために鋭利された後; （代わりに、通常の175μmの）作動距離より約1ミリメートルになるように針の位置を変更。 白金前駆体を用いた場合は、（代わりに通常の40℃）24〜26℃にその動作温度を変更してください。これらのステップは、Ptを低温堆積13のために必要とされる。 SEM室を開き、クライオ試料ステージと交流を装着することにより、低温モード用のFIB / SEMを準備します。 挿入された位置に、NMを切り替えて、ACにその銅編組を接続してください。誤っNM先端には手を触れないようにしてください。システムは、極低温で銅編組の柔軟性の喪失は、NMの動きを妨げないことを確認するために挿入されたNMで冷却されるMENT。 数分間乾燥窒素ガスを冷却するためのパイプをパージします。 クライオ準備室と高真空に主試料室ポンプ。 両室を冷却するためにデュアーに液体窒素を追加します。所望の温度に到達するまでお待ちください。 2。サンプル凍結 SEMの転写ホルダーのFIB試料について2 TEMグリッドをマウントします。ドライバーで対応するネジを締めて固定します。 検体のサンプルスタブ適切にマウントし、試料の一部を追加します。試料の種類に応じて、試料は、低温接着剤で又はクランプで固定することができる。最適な凍結を確実にするために、できるだけ少量を使用する。 真空搬送装置（VTD）に、SEMの転写ホルダーを取り付けます。 流し込みステーションに液体窒素を加え、窒素スラッシュを得るために、ポンプダウン。 SLを開く駅やプランジ凍結のSEM転写ホルダーをushing。沸騰が完了し、スラッシュが再び得られるまで再びポンプダウン。それは、エタン又はプロパンスラッシュまたは高圧凍結試料のガラス化を得るためにより適した技術であることに留意されたい。 VTDの真空チャンバ内にSEM転送ホルダを後退させると、それを密封する。 流し込み駅やクライオ準備室のエアロックベント。 クライオ準備室とポンプのエアロックとVTDシールを一致させる。 良好な真空レベルに達すると、VTDおよび外側エアロックのシールを開くために、エアロックピンが係合する。 SEMの転写ホルダーを挿入します。スパッタリング及び破砕のためのサンプル位置を示す準備チャンバ内で摺動接点上のマーキングがある。 必要であれば、サンプルができます冷たいナイフを骨折。より高い温度（通常は-100を設定することにより、昇華6、C）;冷たいスパッタリング装置を用いてのAu / Pd又はPtを被覆（300 V、10ミリアンペア、2〜3ナノメートルのAu / Pdのキャップは60秒）*。昇華は彼らの再結晶化を回避するために、ガラス化したサンプルには使用しないでください。 TEM格子スロットの保護蓋を開くために冷たいナイフを使用してください。 受信の高さ（16ミリメートル*）に試料室中のコールドステージを持参してください。 FIB / SEMにHTを切り、内側のエアロックを開きます。 試料室にSEMホルダーを転送するVTDを使用する。部屋の照明の調光は、このステップで役立つことがあります。 SEMホルダーがコールドステージになると、押し、回転させることによって、VTDを外す。 VTDの真空チャンバ内にVTD棒を奥まで後退させ、内側エアロック、アウターエアロックとVTDシールを閉じます。外側のエアロックは現在、VTDシールを除去して排出することができます。この最後のステップは必要ありませんが、VTD棒が簡単に誤って外れることがありますようにそれが損傷を引き起こす可能性がある、お勧めしますVTDまたはエアロックへ。 3。イオンミリング 両方の列にハイテンションの電源をオンにして、適切な撮像パラメータ（加速電圧設定：電子ビームのための10 kVの、イオンビームのための30 kVの、スポットサイズ：3;作動距離：5ミリメートル、イオンビーム電流：10〜100をイメージングのためのPA、フライス加工用1-3 NA）*。 関心対象の特徴を見つけるためにラメラの抽出前の試料の状態を記録するために画像を取得するために電子ビームを使用する。 抽出のための関心領域（ROI）が識別されると、サンプル自体の地形でもPtの堆積後のROIを簡単に識別するために許可しない限り、イオンビームパターニングによってそれをマーク。増加精度を、Pettersson氏らの方法を使用します。14マーキングは、深く広く、非SELであるクライオ白金蒸着（でカバーされた後、まだ目に見えるであることが十分でなければならないectiveと試料表面の数mm 2）をカバーする。 24〜26℃に前駆体ガスを加熱し、試料表面の上方約1mmの高さGIS針を挿入する（工程1.3も参照）。 電子ビームをイメージしながら、数秒間ガス弁を開く。クライオのPt堆積速度は、GIS針、試料粗さおよびユーザーのシステムの距離に依存し、100〜500Å/秒以上である。これは、最適なパラメータを決定するために、いくつかのテストの堆積を実行することをお勧めします。 生のクライオ-PT堆積は非常に粗く、不均一である。低倍率（例えば、2,000 X）で1000 pAのイオンビームを用いてROIの上に堆積物を硬化させる。クライオ沈着とは異なり、この硬化は、サイト選択的であり、ROIのみで実行する必要があります。この第低温堆積の目的は、イオンビーム損傷から試料の表面を保護するために、イオン間引き13の間カーテニングを低減することである。 にサンプルを傾けて52℃の表面がイオンビームに対して垂直になるように。離れてミルROIの両側に2段々のトレンチ。トレンチのための典型的な寸法は、抽出すべきラメラ、垂直方向（Y）における可変で10〜15ミクロンの方向（X）に並列に20〜30μmであり、最深点で、深さ（Z）を傾斜投資収益率に近い。傾斜は45〜55℃である必要があります。いくつかの楽器では、棚田のトレンチは上部の最深部に粉砕することができる。このような場合には、投資収益率の下でミル1は、イメージ180°、ミル、他側の第1回転させます。材料のスパッタ速度が既知であれば、ミリングの深さを選択することができる。ほとんどの凍結水和試料については、氷のスパッタ速度は、07を使用することができる。 戻って0°にサンプルを傾け、ラメラの側面および下面を切り取るためにイオンビームを使用し、必ずカットマークが全体のラメラを通過させる（これらは棚田の斜面ミルで製粉跡を残す必要があります前のステップでのED）。サンプルの残りの部分にラメラを接続するだけ2小さな橋を残す。 （これは少しのサンプルをシフト可能）、GIS針を挿入します。その先端は、好ましくは側で、ラメラと物理的に接触するまでNMを操縦。 NMは2小さい接続ブリッジのイオンビームビューを妨げていないことを確認します。 数秒のためのGISバルブを開いて、電子ビームを連続撮影によってクライオ沈着を監視します。 Ptをさらに1〜2ミクロンの層がクライオ寄託されている場合には、バルブを閉じてください。 唯一のNMはラメラと接触している点の周りの数μmでPT（ステップ2.6を参照）を硬化。 無料のラメラをカットする高いイオンビーム電流を使用してください。 2接続するブリッジは離れて粉砕されただけでなく、ラメラとサンプルの残りの部分との間の新たな接点を形成した可能性のPtの余分する必要があります。まだ、GIS針を撤回しないでください。 </lI> 慎重にトレンチからラメラを抽出し、少なくとも500μmの試料表面の上に移動し、NMを操縦。唯一のこのステップの後、GIS針を後退させる。 試料ステージの数mmを下げ、TEMグリッドの1が表示されているまでそれを移動します。作業位置にグリッド上の取り付け領域を移動して、GIS針を挿入します。 慎重にTEMグリッド上に取付け領域と物理的に接触添付ラメラを持って来るために、NMを操縦。ラメラ、TEMグリッドとNMの間には圧力や緊張があってはならない。 数秒と低温堆積物のPtのさらに1〜2ミクロンの層のためのガスのバルブを開きます。 唯一のラメラとTEMグリッドとの間の接触点の周りの数μmでPT（ステップ2.6を参照）を硬化。 メキシコの自由ラメラをカットする高いイオンビーム電流を使用してください。これは、NMチップまたはサンプルのいずれかの側に離れて粉砕することによって達成することができる。 T中彼最初のケースは、先端部が、ステップ1.2で説明したように、次回の使用の前に再び先鋭化する必要があります。 OPTIONAL：この段階では、SEMの転写ホルダーを取り、液体窒素で満たされたデュワーでO / Nに格納するVTDを使用することが可能である。液体窒素は空気中の湿気にさらされると、氷の結晶が既に存在しているおよび/または場合は、この転写及びO / Nストレージは、ラメラの表面上の氷の形成を引き起こす可能性があり;しかし、このような汚染は、比較的短時間で次の工程によって除去される。前の手順が完了するまでに数時間を取っている可能性がある次のステップの後に、ストレージ·O / Nが推奨されていないので（昇華により除き、氷の汚染を除去する方法はないだろうとして、それは、これを行うことが適切で可能性がある試料のガラス化が維持される場合）を行うことができない。 52℃にサンプルを傾け、透明度7を電子薄いそれにイオンビームを使用しています。それは、より高い、rougで始めることをお勧めします彼女のビーム電流は、大部分を除去し、最終的にも、加速電圧を低減し、低ビーム電流で表面を研磨微に進みます。ラメラの最終的な厚さはサンプル組成に応じて、100〜200 kVのTEMでの超微細構造解析のための100〜200 nm以下または300 kVのTEMでの断層撮影では最大500程度にする必要があります。間伐時には、サンプルの内部応力がカールするラメラや曲がりの原因となります。このような場合には、薄くなった領域が制限されるべきである。これは、 図11および12に、例えば、起こった。 TEMに4。クライオトランスファー 数分間乾燥窒素ガスをクライオ乗換駅をフラッシュします。 TEM交流のデュワーへとクライオトランスファーステーションに液体窒素を追加します。 クライオ搬送ステーションの適切なスロットにクライオトランスファーTEMホルダーを挿入し、同様にそのデュワーを埋める。各コンプまで待ってonentは、所望の温度（約15分）に達した。可能であれば、クライオ転写TEMホルダのコントローラは、転写時の温度を監視するために接続されるべきである。これは、（温度センサが配置されている）TEMホルダの先端がクライオ搬送ステーションと接触するので、TEMホルダの残りの部分よりもはるかに速くを冷却することを認識することが重要である。したがって、冷却する全体クライオトランスファーTEMホルダーのために必要な時間は、予め測定し、システムは時間の少なくともその量のために熱化を許可されていることをお勧めします。 液体窒素で極低温カップを満たし、その中に浸す。所望の温度にそれらの先端を冷却するために、TEM試料クランプツール、ドライバーとピンセットを。操作者の手に冷たい火傷を引き起こさないように、すべてのツールが正しく他端に絶縁されるべきである。 外側のエアロックにVTDと一致する。冷たいクワガタをもたらす搬送高（16ミリメートル*）へのE。ハイテンションの電源をオフにします。 VTDシール、外側と内側のエアロックエアロックを開きます。 時計回りに押し、回転させることで、SEM転送ホルダーにロックするVTDロッドを使用してください。 クライオ準備室に、SEMの転写ホルダーを撤回。 TEMグリッドの保護蓋を閉じるように冷たいナイフを使用してください。これは、転送中の可能な氷の汚染を低減する必要がある。 VTDの真空チャンバー内に試料を移動するためにVTDロッドを使用してください。 エアロックを閉じて密閉する。 外側のエアロックをベントし、VTDを切り離す。クライオ乗換駅のSEMポートにVTDと一致する。乾燥窒素でフラッシュしながら、VTDのシールを開き、クライオ乗換駅のデュワーへのSEM転写ホルダーをスライドさせるステーションでピンを使用しています。 クライオ搬送ステーションでのレベルが十分に高いように、十分な液体窒素を入れるサンプルのみを沈めた。 蓋の1を開いて、所定の位置にTEMグリッドを保​​っている、対応するネジを緩めるために、以前に冷却されたドライバーを使用しています。 TEMグリッドを選択し、TEMホルダーにそれを置くために、以前に冷却されたピンセットを使用してください。 TEMホルダーにTEMグリッドを固定するために冷却hexringを使用しています。 クライオトランスファーTEMホルダーのシャッターを閉じます。サンプル移送工程が重要であり、小型のTEM試料の可視性を減少させる窒素ガスによって妨げられるかもしれない。 一緒クライオトランスファーTEMホルダーのヒータコントローラと、ポンプシステムからクライオ搬送ステーションを取り外し、TEMの近くにそれを輸送。 TEMのエアロックにバッキングラインを送り出す、TEMのターボ分子ポンプを起動します。 -70°のチルト*へのTEM試料ステージを設定します。 乾燥窒素ガスでパージの1サイクルのみで、エアロック（30〜60秒）のための最短のポンピング時間を設定します。 </李> クライオトランスファーTEMホルダーの保護シャッターが閉じていることを確認してください。クライオ乗換駅からのTEMホルダーを外し、傾いた角度計（液体窒素は、TEMホルダーデュワーからこぼれん）に挿入します。ポンピングサイクルが開始されます。サイクルが完了すると、0°に戻って傾斜するゴニオメータを設定し、それはゴニオメーターで回転しないようにし、同時に、TEMホルダを保持する。 TEMの中に完全に挿入します。このステップの間に、クライオ転写TEMホルダは、温度を監視するためのヒーターコントローラに接続されるべきである。 TEM内に試料ホルダーを挿入する手順が異なるのTEM間で異なる場合があります。したがって、適切な手順を取得するために、TEMの製造元に連絡することをお勧めします。 クライオトランスファーTEMホルダーデュワーを補充します。許容可能なレベルに到達するために、TEMの真空を待つ。