Крио-электронной микроскопии Изготовление образцов с помощью электронного луча, сфокусированного

ПРИМЕЧАНИЕ: все параметры, указанные в этом протоколе действительны для приборов и моделей, указанных здесь. Некоторые из этих параметров (помеченные знаком * в тексте) могут отличаться, если используется другой производитель или модель. 1. Запуск из FIB / SEM Установите специально построенный холодной наноманипулятор (Нью-Мексико) наконечник без крепления косы Cu в anticontaminator (переменного тока). Вместо этого убедитесь, что косы подключены к остальной части NM выше точки изоляции, чтобы предотвратить заряд во время стадии заточки (1.2). Закройте камеру SEM, насос высокого вакуума и изображения наконечника Н.М.. Если кончик тупой, не изогнутые или загрязнены предыдущего использования, резкость его с помощью ионного пучка: выберите полигональные модели фрезерных вдоль сторон наконечника, так что после фрезерования, кончик будет сужаться до 1 мкм или менее. После того, как стороны наконечника быть удалена фрезерованием, вручную вращаться на 90 ° всего NM стержняснаружи камеры SEM. Отрегулируйте полигональных моделей фрезерных адаптироваться к повернутой наконечника и повторите фрезерование под другим углом. Как только верхушка была заточена, чтобы быть менее 1 мкм, убрать нм и вставить иглу газовой системы впрыска (ГИС); переместить иглу быть около 1 мм над рабочей дистанции (вместо обычного 175 мкм). При использовании предшественника Pt, изменить его рабочую температуру до 24-26 ° C (вместо обычного 40 ° C). Эти шаги необходимы для крио-осаждения 13 Pt. Откройте камеру SEM и подготовить FIB / SEM для крио-режиме за счет установки на сцену образец крио и AC. Переключите NM на введенном положении и соединить свои косы Cu к AC. Убедитесь, что не случайно коснуться кончиком нм. Система охлаждения с NM вставлен, чтобы убедиться, что потеря гибкости оплетки Cu при криогенных температурах не будет препятствовать Н.М. ходМент. Продуть трубы для охлаждения с сухим газообразным азотом в течение нескольких минут. Насос препарат камеру крио и основную камеру с образцом в высоком вакууме. Добавить жидкий азот с сосудами Дьюара для охлаждения обеих палат. Подождите, пока желаемая температура не будет достигнута. 2. Образец Замораживание Установите два ПЭМ сетки для образцов FIB на держателе передачи SEM. Закрепите их, затянув соответствующие винты с помощью отвертки. Установите образец заглушки, подходящие для образца и добавить часть образца. В зависимости от типа образца, образец может быть установлена ​​с криогенной клея или с помощью зажима. Используйте суммы как можно меньше, чтобы обеспечить оптимальную замерзания. Установите держатель передачи SEM на вакуумного переноса устройства (VTD). Добавить жидкий азот в промывочные станции и откачивают для получения азота слякоть. Откройте слushing станции и погружные заморозить держатель передачи SEM. Насос снова до кипения, пока не завершится и слякоть получается снова. Следует отметить, что этан или пропан шуга или замораживание высокого давления лучше подходят методы, чтобы получить витрификации образца. Уберите держатель передачи SEM в вакуумной камере ВТД и запечатать его. Удалить воздух из промывочные станции и крио подготовка камеры шлюз. Подходим печать VTD с шлюза на подготовку камеры крио и насосом. При достижении хороший уровень вакуума, участвовать в шлюзовую булавку, чтобы открыть печать ВТД и внешней шлюз; вставьте держатель передачи SEM. Есть маркировки на скользящих контактов в подготовке камер, обозначающих положение образца для распыления и трещин. При необходимости, образец может быть: перелом с холодным ножом; сублимированный, установив более высокую температуру (обычно -1006, С); покрыты Au / Pd или Pt путем холодной распылител (300 В, 10 мА, 60 сек в течение 2-3 нм Au / Pd крышки) *. Сублимация не должны использоваться для глазурованных образцов, чтобы избежать их перекристаллизации. Используйте холодную нож, чтобы открыть защитные крышки из пазов сетки ТЕА. Принесите холодной этап в камере пробы на высоту приемной (16 мм *). Выключите HT на FIB / SEM и откройте внутреннюю воздушную пробку. С помощью Vtd передавать держатель SEM в отборную камеру. Затемнение освещения в помещении может помочь в этом шаге. Как только держатель SEM находится в холодной стадии, расцепить Vtd, нажав и вращение. Уберите стержня Vtd всю дорогу в вакуумную камеру VTD и закрыть внутренний шлюз, внешний шлюз и печать VTD. Внешний шлюз теперь может выходить снять пломбу VTD. Этот последний шаг не требуется, но рекомендуется как стержень ВТД можно легко смещаются случайно, что может привести к повреждениюк ВТД или шлюза. 3. Ион фрезерные Включите высокой напряженности с обеих колонн и установить соответствующие параметры изображения (ускоряющее напряжение: 10 кВ для электронного пучка, 30 кВ для ионного пучка; размер пятна: 3; рабочее расстояние: 5 мм, текущие ионного пучка: 10-100 пА для работы с изображениями, 1-3 нА для фрезерования) *. С помощью электронного луча, чтобы найти функцию интереса и получать изображения для документирования состояния образца до экстракции пластинки. После того, как область интереса (ROI) для добычи был определен, отметьте его на ионного пучка паттерна, если топография самого образца не позволяет легко идентификации ROI даже после нанесения Pt. Для повышения точности, используйте метод, описанный Петтерссон и др. 14. Маркировка должна быть глубокой, широкой и достаточно далеко, чтобы быть до сих пор видны после того, покрываются осаждения крио-Pt (который не является Сельective и будет охватывать несколько мм 2 поверхности образца). Нагрейте газ предшественника до 24-26 ° С и вставьте ГИС иглу в высоту около 1 мм над поверхностью образца (см. также шаг 1.3). Хотя визуализации с электронным пучком, открыть газовый вентиль в течение нескольких секунд. Скорость осаждения крио-СТ 100-500 нм / сек или более, в зависимости от расстояния от ГИС иглы, образца шероховатости и системе пользователя. Желательно, чтобы запустить несколько тестовых показания для определения оптимальных параметров. Сырой осаждения крио-Pt очень грубо и неоднородным. Лечение депозита по ROI с помощью ионного пучка 1000 Па при малом увеличении (например 2000 X). В отличие от осаждения крио, это отверждения сайт селективный и должна быть выполнена только на рентабельности инвестиций. Цель этого первого крио-осаждения заключается в защите поверхности образца от повреждений ионного пучка и снизить curtaining в процессе ионного истончение 13. Наклоните образец52 ° так, чтобы поверхность была перпендикулярна ионного пучка. Mill далеко две террасы траншеи по обе стороны от ROI. Типичные размеры для окопах 20-30 мкм в направлении (X), параллельной пластинки, предназначенных для извлечения, 10-15 мкм в перпендикулярном направлении (Y) и с переменной, склоняя глубину (Z), с самой глубокой точке близко к ROI. Наклон должен быть 45-55 °. В некоторых инструментов, террасные траншеи можно измельчить только с самой глубокой точке на вершине. В таком случае, мельница один под ROI, затем поверните изображение на 180 ° и мельницы второй на другой стороне. Глубина фрезерования может быть выбран, если скорость распыления материала известно. Для большинства замороженных гидратированных образца, скорость распыления льда можно использовать 7. Наклоните образец обратно в 0 ° и использовать ионный пучок, чтобы срезать стороны и нижней стороне пластинки, убедившись, что вырезать знаки пройти весь ламели (они должны оставить фрезерные следы на террасах склонов мельницыред в предыдущем шаге). Оставьте только два маленьких мосты, соединяющие ламель с остальной частью образца. Вставьте иглу ГИС (это могут незначительно сдвинуть образец). Маневр NM, чтобы его конец не находится в физическом контакте с пластинки, предпочтительно на стороне. Убедитесь, что Н.М. не препятствуя при этом вид ионного пучка из двух небольших соединительных мостов. Откройте клапан ГИС в течение нескольких секунд и контролировать отложение крио непрерывной съемки с электронным пучком. Если дополнительный 1-2 мкм слой Pt был крио-хранение, закрыть клапан. Вылечить Pt (см. шаг 2.6) только в нескольких мкм вокруг точки, где Н.М. находится в контакте с пластинки. Используйте большой ток ионного пучка, чтобы сократить ламель бесплатно. Два соединительных мостов следует фрезерованием, а также любой избыток Pt, которые могут быть сформированы новые точки контакта между пластинки и остальной частью образца. Не убрать иглу ГИС еще. </lя> Осторожно маневрировать нм для извлечения ламель из траншей и переместить его по меньшей мере 500 мкм над поверхностью образца. Только после этого шага, убрать иглу ГИС. Опустите предметный столик несколько мм и не двигаться, пока один из ТЕМ сеток в поле зрения. Переместить область прикрепления на сетке в рабочее положение и вставить иглу ГИС. Тщательно маневрировать NM принести прилагаемый ламель в физический контакт с области крепления на ТЕА сетки. Там не должно быть никакого давления или трения между пластинки, ТЕА сеткой и Нью-Мексико. Откройте газовый вентиль в течение нескольких секунд и крио-депозита дополнительный 1-2 мкм слой Pt. Вылечить Pt (см. шаг 2.6) только в нескольких мкм вокруг точки контакта между ламелей и ТЕА сетки. Используйте большой ток ионного пучка, чтобы сократить ламель свободным от Нью-Мексико. Это может быть достигнуто путем измельчения в сторону либо наконечник нм или стороне образца. В тон первый случай, наконечник должны быть заточены снова до следующего использования, как описано на стадии 1.2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: на данном этапе можно использовать Vtd взять держатель передачи SEM и хранить его O / N в Дьюара с жидким азотом. Эта передача и O / N хранение может вызвать образование льда на поверхности пластинки, если кристаллы льда уже присутствуют и / или, если жидкий азот подвергается воздействию влажного воздуха; но такое загрязнение будут удалены следующий шаг в относительно короткий период времени. Как предыдущие шаги, возможно, взяли несколько часов, это может быть уместно сделать это, так как после следующей стадии такое хранение O / N не рекомендуется, так как не было бы никакой возможности, чтобы удалить загрязнения льда исключением сублимацией (который не может быть выполнена, если стеклования образца должна поддерживаться). Наклоните образец до 52 ° и использовать ионный пучок, чтобы он тонкий электрон прозрачности 7. Рекомендуется начать с высшего, Rougее токи пучка для удаления основной массы и перейти к тонкой полировки поверхности с более низкими токах пучка, в конечном счете также снижения ускоряющего напряжения. Конечная толщина пластинки должны быть 100-200 нм или меньше для анализа ультраструктуры в кВ ТЭМ 100-200 или до 500 нм для томографии в кВ ТЭМ 300, в зависимости от состава образца. Во время прореживания, внутренние напряжения образца может привести ламели свернуться или изгиб. В таком случае область разбавленной должен быть ограничен. Это произошло, например, в рисунках 11 и 12. 4. Крио Трансфер в TEM Промойте крио-передачи станции с сухим азотом в течение нескольких минут. Добавить жидкий азот в сосуд Дьюара ТЕА AC и в крио-передаточной станции. Вставьте держатель ПЭМ крио-передачи в соответствующий слот в крио-передаточной станции и заполнить его Дьюара, а также. Подождите, пока каждый компonent достигла желаемой температуры (около 15 мин). Если это возможно, контроллер держателя ПЭМ крио-передачи должен быть подключен для контроля температуры в процессе передачи. Важно понимать, что кончик держателя ТЕА (где датчик температуры расположен) будет находиться в контакте с крио-передаточной станции и, следовательно, будет остывать гораздо быстрее, чем остальной части держателя ПЭМ. Поэтому рекомендуется, что время, необходимое для всей крио-передачи держателя ПЭМ остынет есть предварительно измерить, и что система разрешается термализовать, по крайней мере, что количество времени. Заполните криогенную чашку с жидким азотом и погрузиться в нее: ТЕА образец зажимного инструмента, отвертки и пинцет, для того, чтобы остыть свои советы до нужной температуры. Все инструменты должны быть надежно изолированы на другом конце, чтобы не вызвать холодные ожоги руки оператора. Матч Vtd к внешнему шлюзу. Принесите холодной оленяэ с высотой переноса (16 мм *). Выключите высокую напряженность. Откройте печать VTD, внешний шлюз, а внутренний шлюз. Используйте стержень VTD заблокировать в держатель передачи SEM, нажав и вращая по часовой стрелке. Уберите держатель передачи SEM в крио подготовки камеры. Используйте холодную нож, чтобы закрыть защитные крышки ТЕА сетей. Это необходимо для уменьшения возможного загрязнения льда во время передачи. Используйте стержень VTD для перемещения образца в вакуумной камере ВТД. Закройте шлюзы и уплотнение. Vent внешний шлюз и отсоедините Vtd. Матч Vtd к порту SEM в крио-передаточной станции. В то время как промывка сухим азотом, используйте булавку на станции, чтобы открыть печать ВТД и сдвиньте держатель передачи SEM в дьюаре крио-передаточной станции. Добавьте достаточно жидкого азота так, чтобы уровень жидкости в крио-передаточной станции достаточно высокапросто погрузить образец. Используйте предварительно охлажденный отвертку, чтобы открыть одну из крышек и ослабить соответствующий винт, который держит ПЭМ сетку на месте. Используйте предварительно охлажденный пинцет, чтобы забрать ТЕА сетки и поместить его в держатель ПЭМ. Используйте охлажденного hexring для крепления ТЕА сетки на держатель ПЭМ. Закройте затвор держателя ПЭМ крио-передачи. Шаг передачи образец имеет решающее значение и может быть затруднено азота снижения заметности небольшой выборке ПЭМ. Отключите крио-передачи станции из насосной системы и транспортировать его рядом ТЕА вместе с нагревателем контроллера держателя ПЭМ крио-передачи. Запустите турбомолекулярным насос ТЕА накачать защитную линию к шлюзу ПЭМ. Установите этап образец ТЭМ к наклона * от -70 °. Установите наименьшее время накачки для шлюза (30-60 сек), и только один цикл продувки сухим азотом. </литий> Убедитесь, что защитная шторка на держателе ТЕМ крио-передачи закрыта. Снимите держатель ПЭМ от крио-передаточной станции и вставить его в наклонной гониометра (жидкий азот будет высыпался из держателя ПЭМ Дьюара). Цикл откачки начнется. После завершения цикла, установить гониометра, чтобы наклонить назад до 0 ° и, в то же время, удерживая держатель ПЭМ так, что она не вращается с гониометра. Вставьте ее полностью внутри ТЕА. На этом этапе, владелец ТЕМ крио-передачи должен быть подключен к ее контроллера нагревателя для контроля температуры. Процедура вставить держатель образца в ТЕА может варьироваться от различных TEMS. Поэтому рекомендуется обратиться к производителю ПЭМ получить соответствующую процедуру. Заполните крио-передачи держатель ТЕМ Дьюара. Подождите вакуума в ТЕА достичь приемлемого уровня.