Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

NOTA: tutti i parametri indicati nel presente protocollo sono validi per gli strumenti ei modelli qui indicati. Alcuni di questi parametri (contrassegnati con * nel testo) possono variare se si utilizza un altro fabbricante o il modello. 1. Start-up del FIB / SEM Montare il nanomanipulator freddo custom-built (NM) punta senza associare le trecce Cu al anticontaminator (AC). Invece assicurarsi che le trecce sono collegate al resto della NM sopra del punto di isolante per impedire carica durante la fase di affilatura (1.2). Chiudere la camera di SEM, pompa ad alto vuoto e l'immagine della punta NM. Se la punta è smussata, piegato o contaminata dall'uso precedente, affinare mediante il fascio di ioni: selezionare motivi fresatura poligonali lungo i lati della punta, in modo che dopo la fresatura, la punta si cono fino a 1 micron o meno. Una volta che i lati della punta sono stati fresati distanza, ruotare manualmente di 90 ° l'intera asta NMdall'esterno della camera di SEM. Regolare le sagome di fresatura poligonali di adattarsi alla punta ruotato e ripetere fresatura da una diversa angolazione. Una volta che la punta è stata affilata per essere inferiore a 1 micron, ritrarre il NM e inserire l'ago del sistema di iniezione del gas (GIS); riposizionare l'ago di essere a circa 1 mm sopra la distanza di lavoro (invece del solito 175 micron). Se si utilizza un precursore Pt, modificare la temperatura di esercizio a 24-26 ° C (invece dei soliti 40 ° C). Sono necessari questi passaggi per crio-deposizione 13 del Pt. Aprire la camera di SEM e preparare il FIB / SEM per crio-mode montando il palco del campione crio e l'aria condizionata. Passare il NM in posizione inserito e collegare le sue trecce Cu all'AC. Assicurarsi di non toccare accidentalmente la punta NM. Il sistema viene raffreddato con l'NM inserito per assicurarsi che la perdita di flessibilità della treccia Cu a temperature criogeniche non ostacolare il movimento NMmento. Spurgare i tubi per il raffreddamento con azoto secco per qualche minuto. Pompare la camera di preparazione crio e la principale camera del campione per alto vuoto. Aggiungere azoto liquido per le Dewars raffreddare entrambe le camere. Attendere fino al raggiungimento della temperatura desiderata. 2. Congelamento del campione Montare due griglie TEM per i campioni FIB sul supporto di trasferimento SEM. Fissarli serrando le corrispondenti viti con un cacciavite. Montare un campione stub appropriato per il campione e aggiungere una parte del campione. A seconda del tipo di campione, il campione può essere fissato con colla criogenico o con un morsetto. Utilizzare gli importi piccoli quanto possibile per garantire il congelamento ottimale. Montare il supporto di trasferimento SEM sul dispositivo di trasferimento a vuoto (VTD). Aggiungi azoto liquido nella stazione slushing e pompa giù per ottenere granita di azoto. Aprire la slStazione ushing e tuffo-congelare il titolare di trasferimento SEM. Pompare giù di nuovo fino a ebollizione è completato e fango si ottiene di nuovo. Va notato che un etano o propano granite o congelamento ad alta pressione sono tecniche più adatte per ottenere la vetrificazione del campione. Ritrarre il supporto di trasferimento SEM nella camera a vuoto del VTD e sigillarla. Vent la stazione slushing e la crio camera stagna camera di preparazione. Far corrispondere il sigillo VTD con la camera di compensazione della camera di preparazione crio e la pompa. Quando un buon livello di vuoto viene raggiunto, innestare il perno di camera di compensazione per aprire il sigillo del VTD e la camera di equilibrio esterno; inserire il supporto di trasferimento SEM. Ci sono indicazioni sui contatti striscianti nelle camere di preparazione indicano la posizione del campione per sputtering e fratturazione. Se necessario, il campione può essere: fratturato con il coltello freddo; sublimata impostando una temperatura più alta (solitamente -1006, C); rivestito con Au / Pd o Pt mediante il sputterer freddo (300 V, 10 mA, 60 sec per un 2-3 nm tappo Au / Pd) *. Sublimazione non deve essere usato per i campioni vetrificati per evitare la loro ricristallizzazione. Usare il coltello freddo per aprire i coperchi di protezione degli slot della griglia TEM. Portare la fase fredda nella camera del campione all'altezza ricevente (16 mm *). Spegnere l'HT sul FIB / SEM e aprire la camera di equilibrio interiore. Utilizzare il VTD per trasferire il titolare SEM nell'apposita camera. Oscuramento l'illuminazione nella stanza può aiutare in questo passaggio. Il vano SEM è in fase di freddo, disinnestare la VTD premendo e ruotando. Ritrarre l'asta VTD fino in camera a vuoto VTD e chiudere la camera di equilibrio interiore, la camera di compensazione esterna e la guarnizione VTD. La camera di equilibrio esterno può ora essere scaricata per rimuovere il sigillo VTD. Questo ultimo passaggio non è obbligatorio, ma è consigliato come l'asta VTD può essere facilmente sloggiato da incidenti, che possono causare dannial VTD o la camera di equilibrio. 3. Fresatura Ion Accendere l'alta tensione su entrambe le colonne e impostare i parametri di imaging appropriati (tensione di accelerazione: 10 kV per il fascio di elettroni, 30 kV per il fascio di ioni; dimensioni posto: 3; distanza di lavoro: 5 millimetri, attuali fascio ionico: 10-100 pA per l'imaging, 1-3 nA per la fresatura) *. Utilizzare il fascio di elettroni per trovare una caratteristica di interesse e per acquisire immagini per documentare lo stato del campione prima dell'estrazione della lamella. Una volta identificato una regione di interesse (ROI) per l'estrazione, segnare da fascio ionico patterning, a meno che la topografia del campione stesso permette una facile identificazione del ROI anche dopo Pt deposizione. Per una maggiore precisione, utilizzare il metodo descritto da Pettersson et al. 14 Le marcature devono essere profonda, ampia e abbastanza lontano da essere ancora visibile dopo essere stato coperto dalla deposizione crio-Pt (che è non-selcace e coprirà diversi mm 2 della superficie del campione). Riscaldare il gas precursore di 24-26 ° C e inserire l'ago GIS ad una altezza di circa 1 mm al di sopra della superficie del campione (vedi anche punto 1.3). Mentre l'imaging con il fascio di elettroni, aprire la valvola del gas per alcuni secondi. Il tasso di crio-Pt deposizione è 100-500 nm / sec o più, a seconda della distanza dell'ago GIS, la rugosità campione e sistema dell'utente. È consigliabile eseguire alcune deposizioni di prova per determinare i parametri ottimali. La prima crio-Pt deposizione è molto agitato e disomogeneo. Curare il deposito sul ROI utilizzando un fascio di ioni di 1.000 pA a basso ingrandimento (per esempio 2.000 X). A differenza della deposizione crio, questo indurimento è sito selettiva e deve essere eseguita solo sul ROI. Lo scopo di questa prima crio-deposizione è proteggere la superficie del campione da danni fascio di ioni e di ridurre curtaining durante ione assottigliamento 13. Inclinare il campione52 ° in modo che la superficie è perpendicolare al fascio di ioni. Mill distanza di due trincee a schiera su entrambi i lati del ROI. Dimensioni tipiche per le trincee sono 20-30 micron di direzione (X) parallelo alla lamella da estrarre, 10-15 micron in direzione perpendicolare (Y) e con una variabile, pendenza profondità (Z), con il punto più profondo vicino alla ROI. La pendenza deve essere 45-55 °. In alcuni strumenti, trincee a schiera possono essere fresati solo con il punto più profondo sulla parte superiore. In tal caso, un mulino sotto la ROI, quindi ruotare l'immagine di 180 ° e il mulino secondo sull'altro lato. La profondità di fresatura può essere selezionato se il tasso di polverizzazione del materiale è noto. Per la maggior parte campione congelato-idratato, il tasso sputter di ghiaccio può essere utilizzato 7. Inclinare il campione torna a 0 ° e utilizzare il fascio di ioni di tagliare via i lati e la parte inferiore della lamella, assicurandosi che i segni di taglio passare attraverso l'intero lamella (dovrebbero lasciare segni di fresatura sul mulino pendii terrazzatiDE al passaggio precedente). Lasciare solo due piccoli ponti che collegano la lamella al resto del campione. Inserire l'ago GIS (puo 'spostare leggermente il campione). Manovrare la NM finché la punta è in contatto fisico con la lamella, preferibilmente sul lato. Assicurarsi che il NM non ostruisca la vista del fascio ionico due piccoli ponti di collegamento. Aprire la valvola GIS per pochi secondi e monitorare la deposizione crio da imaging continuo con il fascio di elettroni. Quando un ulteriore strato di 1-2 micron di Pt è stato crio-depositato, chiudere la valvola. Curare il Pt (vedi passo 2.6) solo in pochi micron intorno al punto in cui il NM è in contatto con la lamella. Utilizzare una corrente elevata fascio di ioni di tagliare la lamella libera. I due ponti di collegamento devono essere fresati distanza, nonché qualsiasi eccesso di Pt che possono essersi formate nuovi punti di contatto tra le lamelle e il resto del campione. Non ritrarre ancora l'ago GIS. </li> Manovrare con cautela la NM per estrarre la lamella dalle trincee e spostarlo almeno 500 micron sopra la superficie del campione. Solo dopo questa fase, retrarre l'ago GIS. Abbassare la fase del campione di pochi mm e portarlo a una delle griglie TEM è in vista. Spostare l'area di attacco sulla griglia in posizione di lavoro e inserire l'ago GIS. Manovrare con cautela la NM per portare la lamella divisoria in contatto fisico con la superficie di attacco sulla griglia TEM. Non ci dovrebbe essere pressione o tensione tra la lamella, la griglia TEM e il NM. Aprire il rubinetto del gas per pochi secondi e crio-deposito di un ulteriore strato di 1-2 micron di Pt. Curare il Pt (vedi passo 2.6) solo in pochi micron attorno al punto di contatto tra la lamella e la griglia TEM. Utilizzare una corrente elevata fascio di ioni di tagliare la lamella libera del NM. Questo può essere ottenuto dalla macinazione di distanza sia la punta NM o il lato del campione. In tegli primo caso, la punta dovrà essere affilati nuovamente prima dell'uso successivo, come descritto al punto 1.2. OPTIONAL: in questa fase è possibile utilizzare il VTD per prendere il titolare trasferimento SEM e memorizzarlo O / N in un Dewar contenente azoto liquido. Questo trasferimento e la memorizzazione O / N sia tale da provocare la formazione di ghiaccio sulla superficie della lamella se cristalli di ghiaccio sono già presenti e / o se l'azoto liquido è esposto all'aria umida; ma tale contaminazione verrà rimosso dalla fase successiva in un tempo relativamente breve. Poiché i passaggi precedenti possono aver preso diverse ore per completare, potrebbe essere opportuno farlo, dal momento che dopo il passo successivo tale ammasso O / N non è raccomandato, in quanto non ci sarebbe alcun modo per rimuovere la contaminazione di ghiaccio se non per sublimazione (che non può essere eseguita se la vetrificazione del campione deve essere mantenuta). Inclinare il campione a 52 ° e utilizzare il fascio di ioni sottile al di elettroni trasparenza 7. Si consiglia di cominciare con una maggiore, rougle correnti dei fasci per rimuovere la massa e procedere alla lucidatura fine la superficie con correnti dei fasci inferiori, eventualmente anche riducendo la tensione di accelerazione. Lo spessore finale della lamella dovrebbe essere 100-200 nm o meno per l'analisi ultrastruttura in un TEM 100-200 kV o fino a 500 nm per tomografia in un TEM 300 kV, a seconda della composizione del campione. Durante diradamento, le sollecitazioni interne del campione possono causare la lamella arricciamento o piegarsi. In tal caso, la regione assottigliato deve essere limitato. Ciò avvenne per esempio nelle figure 11 e 12. 4. Cryo Trasferimento a TEM Lavare la stazione crio-transfer con azoto secco per qualche minuto. Aggiungere azoto liquido alla Dewar del TEM AC e alla stazione crio-transfer. Inserire il supporto TEM crio-transfer nello slot appropriato della stazione di crio-trasferimento e riempire il suo Dewar pure. Attendere che ogni bozzettoonent ha raggiunto la temperatura desiderata (circa 15 min). Se possibile, il controllore del titolare TEM crio-trasferimento deve essere collegato per monitorare la temperatura durante il trasferimento. È importante rendersi conto che la punta del titolare TEM (la posizione del sensore di temperatura) sarà in contatto con la stazione crio-transfer e verrà raffreddano pertanto molto più velocemente rispetto al resto del titolare TEM. Pertanto si raccomanda che il tempo necessario per l'intera titolare TEM crio-transfer per raffreddare è misurata in anticipo, e che il sistema è consentito thermalize per almeno tale quantità di tempo. Riempire una tazza criogenico con azoto liquido e immergere in esso: lo strumento campione serraggio TEM, un cacciavite e pinzette, al fine di raffreddare le loro estremità alla temperatura desiderata. Tutti gli strumenti devono essere adeguatamente isolati su l'altra estremità in modo da non causare ustioni alla mano dell'operatore. Far corrispondere il VTD per la camera di equilibrio esterno. Portare il cervo freddoe l'altezza di trasferimento (16 mm *). Spegnere l'alta tensione. Aprire il sigillo VTD, la camera di equilibrio esterno e la camera di equilibrio interiore. Utilizzare l'asta VTD per bloccare nel supporto di trasferimento SEM premendo e ruotando in senso orario. Ritrarre il supporto di trasferimento SEM nella camera di preparazione crio. Usare il coltello fredda per chiudere i coperchi di protezione delle griglie TEM. Ciò è necessario per ridurre la contaminazione ghiaccio possibile durante il trasferimento. Utilizzare l'asta VTD per spostare il campione nella camera a vuoto del VTD. Chiudere le sacche d'aria e di tenuta. Vent la camera di compensazione esterna e staccare il VTD. Far corrispondere il VTD alla porta SEM della stazione di crio-transfer. Durante il lavaggio con azoto secco, usa il perno sulla stazione per aprire il sigillo del VTD e far scorrere il supporto di trasferimento SEM nel Dewar della stazione di crio-transfer. Aggiungere abbastanza azoto liquido in modo che il livello nella stazione crio-transfer è abbastanza altoimmergere solo il campione. Utilizzare il cacciavite in precedenza raffreddato ad aprire uno dei coperchi e allentare la corrispondente vite che sta tenendo la griglia TEM a posto. Utilizzare le pinzette precedentemente raffreddati a raccogliere la griglia TEM e inserirlo nel supporto TEM. Utilizzare il hexring raffreddato per fissare la griglia TEM sul supporto TEM. Chiudere l'otturatore del titolare TEM crio-transfer. La fase di trasferimento del campione è fondamentale e potrebbe essere ostacolato da gas azoto riducendo la visibilità del piccolo campione TEM. Scollegare la stazione crio-trasferimento dal sistema di pompaggio e trasportarlo vicino al TEM, insieme con il controller di riscaldamento del titolare TEM crio-transfer. Avviare la pompa turbomolecolare del TEM per pompare la linea di appoggio per la camera di equilibrio TEM. Impostare la fase del campione TEM ad una inclinazione * di -70 °. Impostare il breve tempo di pompaggio per la camera di compensazione (30-60 sec), con un solo ciclo di lavaggio con gas di azoto secco. </li> Assicurarsi che l'otturatore di protezione sul supporto TEM crio-transfer è chiuso. Rimuovere il supporto TEM dalla stazione di crio-transfer e inserirlo nel goniometro inclinato (azoto liquido fuoriuscire del Dewar titolare TEM). Il ciclo di pompaggio inizierà. Una volta che il ciclo è completato, impostare il goniometro per inclinare di nuovo a 0 ° e, allo stesso tempo, mantenere il supporto del TEM in modo che non ruoti con il goniometro. Inserire completamente all'interno della TEM. Durante questa fase, il titolare TEM crio-trasferimento deve essere collegato ad un regolatore di riscaldamento per controllare la temperatura. La procedura per inserire il supporto del campione nella TEM può variare tra i diversi TEM. Si raccomanda pertanto di contattare il produttore TEM avere la procedura appropriata. Riempire il crio-transfer titolare TEM Dewar. Attendere il vuoto nella TEM per raggiungere un livello accettabile.