Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Nota: Todos os parâmetros indicados no presente protocolo são válidas para os instrumentos e modelos aqui indicados. Alguns desses parâmetros (marcadas com * no texto) pode ser diferente, se um outro fabricante ou modelo é usado. 1. Start-up da FIB / SEM Monte o nanomanipulator frio custom-built (NM) dica sem anexar as tranças Cu ao anticontaminator (AC). Em vez disso, faz-se que as tranças são ligados ao resto do NM acima do ponto de isolamento para impedir a carga durante o passo de afiar (1.2). Feche a câmara de SEM, bomba para alto vácuo e imagem a ponta NM. Se a dica é sem corte, curvado ou contaminado pelo uso anterior, apontá-lo por meio do feixe de íons: selecionar padrões de fresagem poligonais ao longo dos lados da ponta, de modo que após a moagem, a ponta se reduzirá para 1 m ou menos. Uma vez que os lados da ponta ter sido moído de distância, rodar manualmente por 90 ° de toda a haste NMdo lado de fora da câmara de MEV. Ajustar os padrões de fresagem poligonais para se adaptar à extremidade girado e repetir moagem a partir de um ângulo diferente. Uma vez que a ponta foi melhorado para ser inferior a 1 mícron, retraia o NM e inserir a agulha do sistema de injeção de gás (GIS); reposicionar a agulha estar em cerca de 1 mm acima da distância de trabalho (em vez dos habituais 175 um). Se estiver usando um precursor Pt, mudar sua temperatura de funcionamento de 24-26 ° C (em vez dos habituais 40 ° C). Estes passos são necessários para crio-deposição 13 do Pt. Abra a câmara de SEM e preparar o FIB / SEM para modo crio montando o palco amostra crio eo AC. Desligue o NM para a posição inserido e conectar suas tranças Cu para o AC. Certifique-se de não tocar acidentalmente a ponta NM. O sistema é arrefecido com a MN inserido para certificar-se de que a perda de flexibilidade da trança de Cu a temperaturas criogénicas não irá dificultar o movimento NMmento. Purgar os tubos de arrefecimento com azoto gasoso seco durante alguns minutos. Bomba da câmara preparação crio ea principal câmara de amostra de alto vácuo. Adicionar nitrogênio líquido para os Dewars esfriar ambas as câmaras. Aguardar até que a temperatura desejada seja atingida. 2. Congelação Amostra Monte duas grades TEM para amostras FIB no suporte transferência do SEM. Prenda-os, apertando os parafusos correspondentes, com uma chave de fenda. Montar um topo apropriado de amostra para amostra e adiciona uma porção do espécime. Dependendo do tipo de amostra, a amostra pode ser fixada com cola criogénico ou com uma pinça. Use quantidades tão pequenas quanto possível assegurar o congelamento ideal. Monte o suporte de transferência do SEM para o dispositivo de transferência de vácuo (VTD). Adicionar nitrogênio líquido na estação slushing e bombear até obter lama nitrogênio. Abra o slestação ushing e mergulhar-congelar titular transferência do SEM. Bomba para baixo novamente até ferver é completada e lama é obtido novamente. Deve notar-se que uma etano ou propano lama ou congelamento de alta pressão são as técnicas mais adequadas para obter a vitrificação da amostra. Recolha porta-a transferência de SEM para a câmara de vácuo do VTD e selá-lo. Alivie a estação slushing ea câmara preparação câmara crio. Combine o selo VTD com a câmara da câmara de preparação crio e bomba. Quando um bom nível de vácuo é alcançado, envolver o pino câmara para abrir o selo do VTD ea câmara externa; insira o suporte de transferência do SEM. Há marcas nos contatos deslizantes nas câmaras de preparação que indicam a posição da amostra para pulverização e fratura. Se necessário, a amostra pode ser: fraturado com a faca frio; sublimada, definindo uma temperatura mais elevada (geralmente -1006: C); revestido com Au / Pd ou Pt por meio do sputterer frio (300 V, 10 mA, 60 seg de 2-3 nm Au / Pd a tampa) *. Sublimação não deve ser utilizado para amostras de faiança para evitar a sua recristalização. Use a faca fria para abrir as tampas de proteção das ranhuras da grade de TEM. Traga o estágio frio na câmara de amostra para a altura de recepção de 16 mm (*). Desligue o HT na FIB / SEM e abrir a câmara interior. Use o VTD para transferir o suporte do SEM para a câmara de amostra. Escurecer a iluminação no quarto pode ajudar nesta etapa. Uma vez que o titular do SEM está na fase fria, desengatar o VTD, empurrando e girando. Recolha a haste VTD todo o caminho para a câmara de vácuo VTD e fechar a câmara interior, a câmara exterior eo selo VTD. A câmara exterior agora pode ser ventilado para remover o selo VTD. Este último passo não é obrigatório, mas é recomendado como a vara VTD podem ser facilmente retirados por acidente, o que pode causar danosà VTD ou a câmara. 3. Ion Milling Ligue a alta tensão em ambas as colunas e definir os parâmetros de imagem apropriados (tensão de aceleração: 10 kV para o feixe de elétrons de 30 kV para o feixe de íons; tamanho spot: 3; distância de trabalho: 5 mm, feixe de íons atuais: 10-100 pA para imagens, 1-3 nA para fresamento) *. Use o feixe de elétrons para encontrar uma característica de interesse e para a aquisição de imagens para documentar o estado da amostra antes da extração da lamela. Depois de uma região de interesse (ROI) para extracção tem sido identificado, marcá-lo por padrões de feixe de iões, a menos que a topografia da amostra em si permite uma fácil identificação da ROI, mesmo após a deposição de Pt. Para uma maior precisão, utilizar o método descrito por 14 Pettersson et al. As marcações deve ser profunda, ampla e longe o suficiente para ser ainda visível após ter sido coberto pela deposição de crio-Pt (que é não-selectivo e vai cobrir vários mm2 da superfície da amostra). Aquecer o gás precursor de 24-26 ° C, e introduzir a agulha SIG para uma altura de cerca de 1 mm acima da superfície da amostra (ver também o passo 1.3). Enquanto imagem com o feixe de elétrons, abra a válvula de gás por alguns segundos. A taxa de deposição de crio-Pt é 100-500 nm / seg ou mais, dependendo da distância da agulha SIG, a rugosidade da amostra e do sistema do utilizador. É aconselhável executar alguns depoimentos de teste para determinar os parâmetros ideais. A deposição crio-Pt-prima é muito áspera e não homogênea. Cure o depósito sobre o ROI por meio de um feixe de íons de 1.000 pA em baixa ampliação (por exemplo 2.000 X). Ao contrário da deposição de crio, esta cura é local e selectiva deve ser efectuada apenas a ROI. A finalidade deste primeiro crio-deposição é proteger a superfície da amostra de danos do feixe de iões e para reduzir curtaining durante o desbaste de iões 13. Inclinar a amostra para52 °, de modo que a superfície é perpendicular ao feixe de iões. Moinho de distância duas trincheiras em socalcos de ambos os lados do ROI. As dimensões típicas para as trincheiras são 20-30 mM na direcção (X) paralelo à lamela que ser extraído, 10-15 mM na direcção perpendicular (Y) e com uma variável, inclinada de profundidade (Z), com o ponto mais profundo fechar para o ROI. A inclinação deverá ser de 45-55 °. Em alguns instrumentos, terraços trincheiras só pode ser moído com o ponto mais profundo no topo. Nesse caso, uma usina sob o ROI, em seguida, girar a imagem 180 ° e moinho a segunda do outro lado. A profundidade de moagem pode ser seleccionada, se a taxa de pulverização catódica do material é conhecido. Para a maior parte da amostra congelada-hidratado, a taxa de pulverização catódica de gelo pode ser utilizado 7. Incline a amostra de volta para 0 ° e use o feixe de íons para cortar as laterais e inferior da lamela, certificando-se as marcas de corte passar por toda a lamela (possivelmente eles deixarão marcas moagem no moinho socalcosed no passo anterior). Deixar apenas duas pequenas pontes de ligação a lamela com o resto da amostra. Insira a agulha GIS (pode mudar um pouco da amostra). Manobra do NM até sua ponta está em contato físico com a lamela, de preferência ao lado. Verifique se o NM não está obstruindo a visão feixe de íons das duas pequenas pontes de ligação. Abra a válvula de GIS por alguns segundos e monitorar a deposição crio por imagem contínua com o feixe de elétrons. Quando uma camada de 1-2 mM adicional de Pt foi crio-depositado, fechar a válvula. Curar o Pt (ver passo 2.6) apenas em poucos mM em torno do ponto onde o NM está em contacto com a lâmina. Use uma corrente de feixe de iões de alta para cortar a lamela livre. As duas pontes de ligação devem ser moídos de distância, bem como o excesso de Pt, que podem ter sido formados novos pontos de contacto entre a lâmina e o resto da amostra. Não retirar a agulha GIS ainda. </li> Manobrar cuidadosamente o NM para extrair a lamela das trincheiras e movê-la, pelo menos, 500 mm acima da superfície da amostra. Só após esta etapa, retrair a agulha GIS. Abaixe o estágio da amostra alguns mm e movê-lo até que um dos grades TEM está em vista. Movimente a área de fixação no grid para a posição de trabalho e inserir a agulha GIS. Manobrar cuidadosamente o NM para trazer a lamela anexado em contato físico com a área de fixação da grelha TEM. Não deve haver qualquer pressão ou tensão entre a lamela, a grelha TEM e o NM. Abra a válvula de gás para alguns segundos e crio-depósito de uma camada de 1-2 mM adicional de Pt. Cure a Pt (veja o passo 2.6) somente em poucos mM em torno do ponto de contato entre a lamela ea grade TEM. Use uma corrente de feixe de íons de alta para cortar a lamela livre do NM. Isto pode ser realizado por moagem de distância ou a ponta NM ou do lado da amostra. Em tele primeiro caso, a ponta terão de ser afiada de novo antes que a próxima utilização, tal como descrito na etapa 1.2. OPCIONAL: nesta fase, é possível usar o VTD levar titular transferência do SEM e guarde-O / N em um Dewar preenchido com nitrogênio líquido. Esta transferência e armazenagem de O / N é susceptível de provocar a formação de gelo sobre a superfície da lamela se cristais de gelo são já presente e / ou se o azoto líquido é exposto a ar húmido; mas tal contaminação serão removidos pelo passo seguinte num relativamente curto espaço de tempo. À medida que as etapas anteriores pode ter levado várias horas para completar, pode ser apropriado para o fazer, uma vez que após o passo seguinte tal armazenamento O / N não é recomendado, pois não haveria nenhuma maneira de remover a contaminação de gelo, exceto por sublimação (que não pode ser realizado se a vitrificação da amostra deverá ser mantida). Incline a amostra a 52 ° e use o feixe de íons de fina que a do elétron transparência 7. Recomenda-se começar com mais elevado, rougsuas correntes de feixe para remover a maior e proceder à multa polimento da superfície com correntes de feixes inferiores, eventualmente reduzindo também a tensão de aceleração. A espessura final da lamela deverá ser de 100-200 nm ou menos, para a análise de uma ultra-estrutura de 100-200 kV ou MET-se a 500 nm para a tomografia de 300 kV TEM, dependendo da composição da amostra. Durante o desbaste, as tensões internas da amostra pode causar a lamela para enrolar ou dobrar. Em tal caso, a região diluído deve ser restrito. Isto aconteceu por exemplo, nas Figuras 11 e 12. 4. Cryo Transferência para TEM Lave a estação de transferência de crio com gás nitrogênio seco por alguns minutos. Adicionar nitrogênio líquido para o Dewar do TEM AC e para a estação de transferência de crio. Insira o suporte TEM a transferência crio no slot apropriado da estação de transferência de crio e encher sua Dewar também. Espere até que cada amostraonent atingiu a temperatura desejada (cerca de 15 min). Se possível, o controlador de suporte de MET a-transferência de crio deve ser ligada para controlar a temperatura durante a transferência. É importante perceber que a ponta do suporte da ETM (onde o sensor de temperatura encontra-se) estarão em contacto com a estação de transferência de crio e, por conseguinte, irá arrefecer mais rapidamente do que o resto do suporte de MET. Por conseguinte, recomenda-se que o tempo necessário para que todo o suporte de transferência MET-crio para arrefecer é medida previamente, e que o sistema é permitido thermalize para, pelo menos, a mesma quantidade de tempo. Encha um copo criogênico com nitrogênio líquido e mergulhar nele: a ferramenta TEM amostra de fixação, uma chave de fenda e uma pinça, a fim de esfriar suas dicas para a temperatura desejada. Todas as ferramentas devem ser devidamente isoladas na outra extremidade de modo a não causar queimaduras de frio para a mão do operador. Combine o VTD para a câmara externa. Traga o veado frioe à altura de transferência (16 milímetros *). Desligue a alta tensão. Abra o selo VTD, a câmara externa ea câmara interior. Use a vara VTD para travar no suporte transferência do SEM, empurrando e girando no sentido horário. Recolha porta-a transferência de SEM para a câmara de preparação crio. Use a faca fria para fechar as tampas de proteção das grades TEM. Isto é necessário para reduzir a possibilidade de contaminação de gelo durante a transferência. Utilizar a haste VTD para mover a amostra para a câmara de vácuo do VTD. Feche as câmaras pressurizadas e selo. Alivie a câmara exterior e retire o VTD. Combine o VTD à porta SEM da estação de transferência de crio. Enquanto a lavagem com nitrogênio seco, use o pino na estação para abrir o selo do VTD e deslize o suporte a transferência de SEM no Dewar da estação de transferência de crio. Adicionar azoto líquido suficiente para que o nível na estação de transferência de crio seja suficientemente elevadaapenas para submergir a amostra. Use a chave de fenda previamente arrefecido a abrir uma das tampas e solte o parafuso correspondente que está mantendo a grade de TEM no lugar. Use a pinça previamente refrigerado para escolher a grade de TEM e colocá-lo no porta-TEM. Utilizar a hexring arrefecida para prender a grade no suporte MET MET. Feche o obturador do titular TEM a transferência crio. O passo de transferência de amostras é essencial e pode ser dificultada por azoto gasoso reduzir a visibilidade da pequena amostra MET. Desligue a estação de transferência de crio a partir do sistema de bombeamento e transportá-lo perto do MET, em conjunto com o controlador de aquecedor de titular TEM a transferência crio. Ligue a bomba turbomolecular do TEM para bombear a linha de apoio para a câmara TEM. Defina o estágio da amostra TEM a uma inclinação de -70 ° *. Defina o tempo de bombeamento mais curto para a câmara de vácuo (30-60 seg), com apenas um ciclo de purga com gás nitrogênio seco. </li> Certifique-se de que a tampa de protecção no suporte TEM a transferência crio é fechada. Retire o suporte do TEM a partir da estação de transferência de crio e inseri-lo no goniômetro inclinado (nitrogênio líquido vai derramar fora do Dewar titular TEM). O ciclo de bombeamento será iniciado. Uma vez que o ciclo é completado, definir o goniómetro para inclinar para trás a 0 ° C e, ao mesmo tempo, manter o suporte do TEM de modo que ele não roda com o goniómetro. Inseri-lo totalmente dentro do TEM. Durante este passo, o suporte de MET de transferência de crio deve ser ligado ao seu controlador de aquecedor para controlar a temperatura. O procedimento para inserir o suporte da amostra no TEM podem variar entre diferentes TEMs. Portanto, é recomendável entrar em contato com o fabricante TEM obter o procedimento adequado. Encher a transferência crio titular TEM Dewar. Aguarde até que o vácuo na TEM para chegar a um nível aceitável.