Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means
Summary
Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.
Abstract
Burada Aspergillus niger sporları cryo-TEM örneklerini hazırlamak için kullanılan bir protokol mevcut, ancak kolayca mikroorganizmalar ya da çözeltilerin herhangi bir sayı için adapte edilebilir. Biz bir özel inşa cryo-aktarma istasyonu ve modifiye cryo-SEM hazırlama odasına 2 yararlanabilirler. Sporlar, bir sıvı azot çamurlu zeminlerde dalma-dondurulmuş ve ilgi bir bölge seçmek için Cryo-SEM gözlenen, bir kültürden alınmıştır. Ince bir lamel daha sonra bir TEM şebekeye bağlanmış ve daha sonra şeffaflık elektron inceltilmiş, FIB ile elde edilir. Izgara bir cryo-TEM tutucu ve yüksek çözünürlüklü TEM çalışmaları için aktarılır. Soğutulmuş nanomanipulator ucu ve bir cryo-aktarma istasyonunun tanıtımı sayesinde, bu protokol TEM örneklerinin rutin kullanılan FIB hazırlık kriyojenik sıcaklığına basit bir uyarlamasıdır. Bu nedenle de mevcut araçlar, kurulumları ve prosedürlere değişiklikler küçük bir miktar gerektiren avantajları vardır; iuygulamak s kolay; prensip Cryo-TEM numune hazırlama gibi aynı, geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir. Bir sınırlama bulaşmaları engellemek veya en aza indirmek için kritik aşamada numunelerin usta işlenmesini gerektirir.
Introduction
Bu protokol daha önce bir cryo-FIB/SEM SEM analizi ile yüksek hassasiyet ile tespit numunenin belirli bir bölge, ikinci TEM örnekleri üretmek için kullanılır. Biyolojik örneklerin elektron mikroskobu (tarama veya iletim) analizi araştırma ve tanı için kullanılan rutin bir tekniktir. SEM oldukça hızlı ve istihdam ve yorumlamak kolay değildir, ancak bilgi sadece numune yüzeyinden ve 1.5 nm aralığında bir çözünürlük elde edilir. TEM daha yüksek bir çözünürlüğe sahiptir, ancak uygulamak daha zordur, görüntü analizi daha basittir ve toplu bir bilgi elde edilir ise, örnekleri (yaklaşık 500 nm kalınlığında daha az) şeffaflık elektron inceltilebilir gerekir. Ek bir sorun, bu araçların bir elektrik gereksinimleri nadiren su-ihtiva eden numuneler ile tolere olmasıdır. Çoğu durumda, biyolojik örnekler kimyasal olarak (polimer, örneğin, su ile ikame edilmesinin) sabit ya da kurutulacak ya sahiptir. Her iki durumda da, önemli değişikliklerNumunenin morfolojisi ve yapısı meydana olasıdır. Hidratlanmış örneklerin Cryo TEM hazırlanması minimal kimyasal değişikliklere neden olur ve bu buz vitrifikasyon 1-6 elde edilir, özellikle, kendi doğal yapısında mümkün olduğu kadar yakın örnekleri üretir.
FIB yaygın olarak sayısız avantajları 7 TEM örnekleri hazırlamak için kullanılır. Birkaç isim: normale yakın sıklığı yüksek enerjili iyonların kullanımı malzeme ilişkili diferansiyel freze oranlarının etkisini en aza indirir; kütle numunesinden ekstre bölgenin bir alt-mikron hassas olarak seçilebilir; malzeme çok az miktarda ekstre edilir. Bazı yeni teknik gelişmeler kriyojenik sıcaklıklarda 2,8-10 de TEM numune hazırlama için de FIB kullanarak mümkün hale getirmiştir. Böyle dilimlenmiş lamelinin mekanik deformasyon eksikliği gibi yumuşak madde örnekleri için ağırlıklı olarak kullanılan kriyo-microtomy 11,12 geleneksel hazırlama yöntemi üzerinde çeşitli avantajları vardırsert / yumuşak arayüzleri veya bileşenleri ile kompozit örnekleri hazırlamak için bıçak işaretleri ve olasılığı olmaması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, oda sıcaklığında malzeme biliminde kullanılan standart FIB / TEM numune hazırlama kriyojenik sıcaklıklara oldukça basit bir uyarlamasıdır. Numune yüzeyi ise homojen olmayan bir perdeleme oluşabilir, ancak bir yöntem olup, bir deformasyon ve bıçak işaretleri (microtomy en önemli dezavantajı) serbest TEM örnekleri üretir. Pürüzsüz ve 13 özelliksiz kadar bu tedavi, bir kapatma tabakası (Bu çalışmada kullanılan Pt), kriyo-birikimi ile azaltılabilir. Çok farklı sertlik bileşenleri olan örnekler bu hazırlama esnasında stres altında kıracak riski olmadan de hazırlanabilir. Iç gerilmeler hala ince lamel bölümün boyutu azaltılmalıdır, bu durumda, viraj ya da bükülmesine neden olabilir. Diğer yönteme göre bir dezavantajı nedeniyle iyon kiriş ve numunedeki iyonlarının olası implantasyon maruziyete biyolojik yapısını değiştirmek için olasılığıdır. Bu sakıncalar da örnek HAZIRLIK oda sıcaklığında meydana gelirmalzeme bilimi 15. lenmesi. Bu iyonlar (500-1000 V) için en düşük hızlandırma gerilimi son bir cilalama aşaması ile incelme tamamlayarak azaltılabilir. Bu çok nazik parlatma adım lamel hasarlı tabakayı ortadan kaldırır.
Nedeniyle Cryo-birikimi (3.5, 3.10 ve 3.13 adımları) doğası gereği, numunenin büyük parçalar böylece orijinal yüzey görünümü engellemekten, işlenecektir. Bu adımda 3.3 önerildiği gibi birden işaretler kullanılmadığı sürece zor, ROI takip yapabilir.
Adımlarla hava ile temas 4.5 ve 4.7 ince lamel riskler sırasında. Bu muhtemelen önemli özellikleri örtücü noktasına, numunenin yüzeyi üzerinde buz kristallerinin oluşturulması için havada nem neden olur gibi kaçınılması gerekir. Bu adımlar, mümkün olduğu kadar çabuk yapılması gerekir, ama aynı zamanda da aktarımı sırasında bir yanlış ele numunenin kaybına yol açması muhtemeldir itkendini. Bu kullanıcı gerçek bir örnek üzerinde bir girişim yapılmadan önce boş TEM ları kullanarak bu adımları uygulamaları önerilir.
Malzeme bilimi, FİB enstrüman ticarileştirilmesi bir on yıl içinde TEM numune hazırlama baş yöntem haline gelmiştir. Hemen hemen her türlü örnek kullanılabilir olduğundan, numune tipine göre hazırlama tekniği uyarlamak için gereksinimini ortadan kaldırır. Önemle aynı, kriyojenik sıcaklıklarda burada ayrıntılı prosedür sayesinde olabilirdi inanıyorum. Büyük numuneler için uygulama hala kriyo korumak bir vitrifiye devlet onları yeteneği tabidir, ancak, 3,5 donma gibi dalma-donma veya yüksek basınç gibi teknikler bu sorunun en iyi çözüm olarak kanıtlamak olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma 7.ÇP Kapasiteler Programı (Grant No INFRA-2010-262163) kapsamında Avrupa Topluluğu Araştırma Altyapıları tarafından finanse QNano Projesi http://www.qnano-ri.eu destek aldı.
Biz de mali destek için araştırma konseyi FORMAS teşekkür ederim.
Materials
| Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
| Omniprobe 100 | Oxford Instruments | nanomanipulator | |
| Alto 2500 | Gatan | cryo preparation chamber | |
| cryo-holder model 626 | Gatan | cryo transfer TEM holder | |
| Tecnai F30 | FEI | TEM | |
References
- Echlin, P. . Low Temperature Microscopy and Analysis. , (1992).
- Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).
- Studer, D., et al. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285 (2001).
- Umrath, W. Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy. J. Microsc. 101, 103 (1974).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, 34 (2003).
- Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. , (1989).
- Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. . Introduction to Focused Ion Beams. , (2005).
- Marko, M., et al. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy. Nat. Methods. 4, 215 (2007).
- Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).
- Rigort, A. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).
- Hsieh, C., et al. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).
- McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 131, 1 (1983).
- Hayles, M. F., et al. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. J. Microsc. 226, 263 (2007).
- Pettersson, H., et al. A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision. Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).
- Wätjen, J. T., et al. Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact. Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).
