Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

OPMERKING: alle parameters gegeven in dit protocol gelden voor de instrumenten en modellen hier aangegeven. Sommige van deze parameters (aangegeven door * in de tekst) kan afwijken als andere fabrikant of model gebruikt. 1. Start-up van de FIB / SEM Monteer de custom-built koud nanomanipulator (NM) tip zonder bevestiging van de Cu vlechten aan de anticontaminator (AC). In plaats daarvan ervoor zorgen dat de vlechten zijn aangesloten op de rest van de NM boven de isolatie punt op te laden te voorkomen tijdens de verscherping stap (1.2). Sluit het SEM kamer, pompen naar hoog vacuüm en het imago van de NM tip. Als de tip is stomp, gebogen of besmet door eerder gebruik, verscherpen door middel van de ionenbundel: selecteer veelhoekige freespatronen langs de zijkanten van de tip, zodat na het malen, zal de punt taps toelopen tot 1 micrometer of minder. Zodra de zijkanten van de tip zijn weg gefreesd, handmatig 90 ° te draaien de hele NM stangvan buiten de SEM kamer. Pas de veelhoekige freespatronen aan te passen aan de gedraaide punt en herhaal frezen vanuit een andere hoek. Zodra de punt is geslepen, om minder dan 1 micrometer, trek de NM en de naald van de Gas Injection System (GIS); positie van de naald zich ongeveer 1 mm boven de werkafstand (in plaats van de gebruikelijke 175 urn). Bij gebruik van een Pt-precursor, veranderen de bedrijfstemperatuur tot 24-26 ° C (in plaats van de gebruikelijke 40 ° C). Deze stappen zijn nodig voor cryo-afzetting 13 van de Pt. Open de SEM kamer en bereiden de FIB / SEM voor cryo-modus door de montage van de cryo monster podium en de AC. Schakel de NM naar de geplaatste positie en sluit de Cu vlechten op de AC. Zorg ervoor dat u niet per ongeluk de NM tip raken. Het systeem wordt gekoeld met de NM opgenomen om ervoor te zorgen dat het verlies aan flexibiliteit van de Cu gevlochten bij cryogene temperaturen NM beweging niet belemmerenment. Spoel de buizen voor koeling met droog stikstofgas gedurende enkele minuten. Pomp de cryo voorbereiding kamer en de belangrijkste monsterkamer te hoog vacuüm. Voeg vloeibare stikstof aan de Dewars beide kamers te koelen. Wacht tot de gewenste temperatuur wordt bereikt. 2. Sample Bevriezing Monteer twee TEM roosters voor FIB monsters op de SEM overdracht houder. Zet ze vast met de bijbehorende schroeven met een schroevendraaier. Monteer een monster stub geschikt is voor het model en voeg een deel van de monsters. Afhankelijk van het monster, kan het monster worden bevestigd met cryogene lijm of met een klem. Gebruik bedragen zo klein mogelijk optimaal worden bevroren. Monteer de SEM overdracht houder op het vacuüm overbrengingsapparaatje (VTD). Voeg vloeibare stikstof in de slushing station en pomp omlaag naar stikstof slush verkrijgen. Open de slushing station en duik-vries de SEM overdracht houder. Pump down weer aan de kook is voltooid en weer slush wordt verkregen. Opgemerkt zij dat ethaan of propaan slush of hogedruk vriezen beter technieken om de verglazing van het monster te verkrijgen. Trek de SEM overdracht houder in de vacuümkamer van de VTD en verzegelen. Vent de slushing station en de cryo voorbereiding kamer luchtsluis. Overeenkomen met de VTD afdichting met de luchtsluis van de cryo voorbereiding kamer en pomp. Wanneer een goede vacuüm is bereikt, gaan de luchtsluis pin om het zegel van de VTD en de buitenste luchtsluis openen; Steek de SEM overdracht houder. Er zijn markeringen op de glijdende contacten in de voorbereiding kamers met vermelding van de steekproef positie voor sputteren en breken. Indien nodig, kan het monster worden: gebroken met de koude mes; gesublimeerd door een hogere temperatuur (gewoonlijk -1006, C); bedekt met Au / Pd of Pt via de koude sproei (300 V, 10 mA, 60 seconden voor een 2-3 nm Au / Pd cap) *. Sublimatie mag niet worden gebruikt voor verglaasd monsters hun herkristallisatie te voorkomen. Gebruik de koude mes om de beschermende deksels van de TEM rooster sleuven openen. Breng de koude fase in de monsterkamer naar de ontvangende hoogte (16 mm *). Schakel de HT op het FIB / SEM en open de binnenste luchtsluis. Gebruik de VTD aan de SEM houder te zetten in de monsterkamer. Dimmen van de verlichting in de kamer kan helpen in deze stap. Zodra de SEM houder is in de koude fase, schakel de VTD door te drukken en te draaien. Trek de VTD staaf helemaal in de VTD vacuümkamer en sluit de binnenste luchtsluis, de buitenste luchtsluis en de VTD afdichting. De buitenste luchtsluis kan nu worden afgevoerd naar de VTD afdichting te verwijderen. Deze laatste stap is niet vereist, maar het wordt aanbevolen als de VTD staaf gemakkelijk kan worden verdreven door een ongeval, wat schade kan veroorzakende VTD of de luchtsluis. 3. Ionenverdunningstechnieken Schakel de hoge spanning op beide kolommen en stel de juiste beeldvormende parameters (versnellende spanning: 10 kV voor de elektronenbundel, 30 kV voor de ionenbundel; stipafmeting: 3; werkafstand: 5 mm, ionenbundelstroom: 10-100 pA voor imaging, 1-3 nA voor frezen) *. Gebruik de elektronenbundel een kenmerk van belang te vinden en om beelden te verwerven om de status van het monster voor de extractie van de lamel documenteren. Zodra een regio van belang (ROI) voor extractie is geïdentificeerd, markeren door ionenbundel patronen, tenzij de topografie van het monster zelf zorgt voor een gemakkelijke identificatie van de ROI, zelfs na Pt depositie. Voor grotere precisie, gebruikt de door Pettersson et al.. Methode 14 De markeringen moeten diep, breed en ver genoeg nog steeds zichtbaar na waarop de cryo-Pt depositie (die niet-sel te zijnecterende en zal enkele mm 2 van het monster oppervlak bedekken). Verwarm de precursor gas 24-26 ° C en breng de GIS naald tot een hoogte van ongeveer 1 mm boven het monsteroppervlak (zie ook stap 1.3). Terwijl de beeldvorming met de elektronenbundel, opent de gasklep voor een paar seconden. De snelheid van cryo-Pt depositie 100-500 nm / s of meer, afhankelijk van de afstand van de GIS naald, het monster en ruwheid van de gebruiker. Het is raadzaam om een ​​aantal verklaringen proef uitgevoerd om de optimale parameters bepalen. De rauwe cryo-Pt depositie is erg ruw en inhomogeen. Genezen van de borg over de ROI met behulp van een 1000 pA ionenbundel bij een lage vergroting (bijvoorbeeld 2000 X). In tegenstelling tot de cryo afzetting Dit uitharding plaats selectief en worden uitgevoerd op alleen de ROI. Het doel van deze eerste cryo-afzetting is het oppervlak van het monster tegen ionenbundel beschadiging en curtaining verminderen tijdens ion dunner 13. Kantel het monster52 ° zodat het oppervlak loodrecht op de ionenbundel. Molen afstand twee rij sleuven aan weerszijden van het ROI. Typische afmetingen voor de sleuven zijn 20-30 urn in de richting (X) parallel aan de lamel te extraheren 10-15 urn in de loodrechte richting (Y) en een variabele, schuin diepte (Z), met het diepste punt dicht bij het ROI. De helling moet 45-55 ° zijn. In sommige instrumenten, kan een rij loopgraven alleen worden gefreesd met het diepste punt op de top. In een dergelijk geval, molen een onder de ROI, roteer vervolgens het beeld 180 ° en molen de tweede aan de andere kant. De diepte van het frezen kan worden geselecteerd als de sputtersnelheid van het materiaal bekend. Voor de meeste bevroren gehydrateerde monster, kan de sputter tarief van ijs worden gebruikt 7. Kantel het monster terug naar 0 ° en gebruik de ionenbundel om weg te snijden de zijkanten en onderkant van de lamel, zorg ervoor dat de snijtekens doorlopen de lamel (ze moeten frezen sporen achterlaten op de terrasvormige hellingen molened in de vorige stap). Voeg slechts twee kleine bruggen die de lamellen met de rest van het monster. Steek de GIS naald (dit kan enigszins verschuiven de steekproef). Manoeuvreren NM totdat de punt is in fysiek contact met de lamellen, bij voorkeur aan de kant. Zorg ervoor dat de NM wordt niet belemmeren van de ionenbundel weergave van de twee kleine verbindingsbruggen. Open het GIS ventiel voor een paar seconden en het toezicht op de cryo afzetting door continue beeldvorming met de elektronenbundel. Als er een extra 1-2 urn van Pt cryo-gedeponeerd is geweest, sluit de klep. Hard de Pt (zie stap 2.6) alleen de enkele urn rond het punt waar de NM in contact is met de lamellen. Gebruik een hoge ionenbundelstroom aan de lamel gratis knippen. De twee aangrenzende bruggen worden weggefreesd, alsmede boven Pt dat nieuwe contactpunten tussen de lamellen en de rest van het monster hebben gevormd. Laat de GIS naald nog niet ingetrokken. </li> Manoeuvreren voorzichtig de NM om de lamel uittreksel uit de loopgraven en beweeg minstens 500 micrometer boven het monster oppervlak. Pas na deze stap, trek de GIS naald. Verlaag het monster podium een ​​paar mm en verplaats het tot een van de TEM roosters is in zicht. Verplaats de bevestiging gebied op de grid naar de werkende stand en steekt de GIS naald. Manoeuvreren voorzichtig NM bijgaande lamel in fysiek contact met het bevestigingsgebied van de TEM rooster brengen. Er mag geen druk of spanning tussen de lamellen, de TEM-net en de NM zijn. Open de gaskraan voor een paar seconden en cryo-depot een extra 1-2 urn van Pt. Cure de Pt (zie stap 2.6) alleen in de paar micrometer rond het punt van contact tussen de lamellen en de TEM-rooster. Gebruik een hoge ionenbundelstroom aan de lamellen vrij van de NM snijden. Dit kan worden bereikt door malen afstand ofwel de NM tip of de zijkant van het monster. In thij eerste geval zal de punt opnieuw worden geslepen voor het volgende gebruik, zoals beschreven in stap 1.2. OPTIONEEL: in dit stadium is het mogelijk om de VTD gebruiken om de overdracht SEM houder nemen en opslaan O / N in een Dewar gevuld met vloeibare stikstof. Deze overdracht en O / N opslag wil ijsvorming veroorzaken op het oppervlak van de lamel als ijskristallen reeds aanwezig en / of de vloeibare stikstof is blootgesteld aan vochtige lucht; maar een dergelijke verontreiniging wordt verwijderd door de volgende stap in een relatief korte tijd. Zoals de vorige stappen enkele uren hebben genomen om te voltooien, kan het aangewezen zijn om dat te doen, want na de volgende stap een dergelijke opslag O / N wordt niet aanbevolen, omdat er geen manier om het ijs te verwijderen vervuiling behalve door sublimatie (zou zijn die kunnen niet worden uitgevoerd als verglazing van het monster moet worden gehandhaafd). Kantel het monster tot 52 ° en gebruik de ionenbundel te dun om de transparantie 7 elektron. Het wordt aanbevolen om te beginnen met hogere, roughaar bundelstromen om het grootste deel te verwijderen en door te gaan naar fijn polijsten van het oppervlak met onderbalk stromingen, uiteindelijk ook het verminderen van de versnellende spanning. De uiteindelijke dikte van de lamellen moet 100-200 nm of minder voor ultrastructuur analyse in een 100-200 kV TEM of tot 500 nm voor tomografie van een 300 kV TEM, afhankelijk van het vloeistofmonster. Tijdens dunner, kan de interne spanningen van het monster veroorzaken de lamel te krullen of buigen. In dat geval moet het gedeelte verdund beperkt. Dit gebeurde bijvoorbeeld in de figuren 11 en 12. 4. Cryo Transfer naar TEM Spoel de cryo-overslagstation met droog stikstofgas voor een paar minuten. Voeg vloeibare stikstof aan de Dewar van de TEM-AC en de cryo-overslagstation. Steek de cryo-TEM overdracht houder in de juiste sleuf van de cryo-overslagstation en vul haar Dewar ook. Wacht totdat elke compponent is de gewenste temperatuur (ongeveer 15 min.) bereikt. Indien mogelijk moet de controller van de cryo-TEM overdracht houder worden aangesloten om de temperatuur te bewaken tijdens de overdracht. Het is belangrijk te beseffen dat het uiteinde van de TEM houder (indien de temperatuursensor bevindt) in contact zal komen met de cryo-overslagstation en derhalve afkoelen sneller dan de rest van de TEM houder. Het wordt daarom aanbevolen dat de tijd die de gehele cryo-TEM overdracht houder afkoelen vooraf wordt gemeten, en dat het systeem mag thermalize tenminste die tijd. Vul een cryogene kop met vloeibare stikstof en dompel daarin: de TEM monster spangereedschap, een schroevendraaier en pincet, om af te koelen hun uiteinden aan de gewenste temperatuur. Alle instrumenten moeten goed geïsoleerd aan de andere kant zodat er geen koude brandwonden aan de hand van de bediener veroorzaken. Overeenkomen met de VTD naar de buitenste luchtsluis. Breng de koude herte om de overdracht hoogte (16 mm *). Schakel de hoge spanning. Open de VTD zegel, de buitenste luchtsluis en de binnenste luchtsluis. Gebruik de VTD stang te vergrendelen in de SEM overdracht houder door te drukken en te draaien met de klok mee. Trek de SEM overdracht houder in de cryo voorbereiding kamer. Gebruik de koude mes om de beschermende deksels van de TEM roosters sluiten. Dit is nodig om mogelijke ijs contaminatie tijdens de overdracht te verminderen. Gebruik de VTD stang waarmee het monster in de vacuümkamer van de VTD bewegen. Sluit de luchtsluizen en afdichting. Vent de buitenste luchtsluis en maak de VTD. Overeenkomen met de VTD aan de SEM-poort van de cryo-overslagstation. Terwijl spoelen met droge stikstof, gebruikt u de pin op het station naar het zegel van de VTD openen en schuif de SEM overdracht houder in de Dewar van de cryo-overslagstation. Voeg genoeg vloeibare stikstof, zodat het niveau in de cryo-overslagstation is hoog genoeggewoon onderdompelen het monster. Gebruik de eerder gekoeld schroevendraaier om een ​​van de deksels te openen en draai de bijbehorende schroef dat is het bijhouden van de TEM rooster op zijn plaats. Gebruik de eerder afgekoeld pincet om de TEM rooster halen en plaats deze in de TEM-houder. Gebruik de afgekoelde hexring de TEM rooster vast op de TEM-houder. Sluit de sluiter van de cryo-TEM overdracht houder. Het monster overdracht stap is cruciaal en zou kunnen worden belemmerd door stikstofgas verminderen van de zichtbaarheid van de kleine TEM monster. Koppel de cryo-overslagstation van het pompsysteem en het vervoer in de buurt van de TEM, samen met de zonneboiler controller van de cryo-TEM overdracht houder. Start de turbomoleculaire pomp van de TEM om de steun lijn pompen om de TEM luchtsluis. Stel de TEM monster podium om een ​​tilt * van -70 °. Stel de kortste pomptijd voor de luchtsluis (30-60 sec), met slechts een cyclus van spoelen met droog stikstofgas. </li> Zorg ervoor dat de beschermende afsluiting van de cryo-TEM overdracht houder is gesloten. Verwijder de TEM houder van de cryo-overslagstation en steek deze in de gekantelde goniometer (vloeibare stikstof zal morsen uit de TEM houder Dewar). De pompen cyclus zal beginnen. Nadat de cyclus is voltooid, zet de goniometer terug kantelen naar 0 ° en, tegelijkertijd, houdt de TEM houder, zodat deze niet meedraait met de goniometer. Breng het goed in de TEM. Tijdens deze stap moet de cryo-TEM overdracht houder verbonden zijn verwarmerregelaar om de temperatuur te controleren. De procedure om de monsterhouder in te voegen in de TEM kunnen variëren tussen verschillende systemen. Het wordt daarom aanbevolen om de TEM fabrikant contacteren om de juiste procedure te verkrijgen. Vul het cryo-TEM overdracht houder Dewar. Wacht totdat het vacuüm in de TEM tot een aanvaardbaar niveau.