Производство большого количества Размер контролируемой опухолевых сфероидов Использование микролунках планшета

Примечание: Микролуночные пластины доступны в различных форматах, в зависимости от желаемых результатов. Технические характеристики, а также приблизительные руководящие принципы для минимальных и максимальных количества клеток, которые должны использоваться с каждым форматом приведены в таблице 1. Меньшие Микролунки конус к резкому точке, и, таким образом, нет никакого нижнего предела размера, хотя изменчивость между сфероидов становится более значительным, при меньших размерах. Регулярное производство сфероидах в среднем с всего за 20 камерами на каждом проста 8. Чем больше размер микролуночный не полностью конические, поэтому попытки сформировать сфероидов из небольшого числа клеток может привести к несколько более мелких сферических частиц в каждую микролунку. Из-за небольших различий в свойствах поверхности, подготовка с раствора ПАВ (шаг 1.2) не является обязательным при использовании AggreWell 400Ex пластины. Этот протокол основан на использовании AggreWell 400 пластин – для других форматов минусыии Таблица 1. Число клеток, загружаемых в каждую лунку определяется путем умножения количества лунок он содержит по количеству ячеек, которые будут кластерных для каждого сфероида. Например, для создания сферических частиц из 1000 клеток за штуку, каждую лунку должны быть загружены (1200 сфероидах раз 1000 клеток каждый =) 1,2 х 10 6 клеток. Плотность клеток должны быть рассчитаны при условии, что эти клетки будут загружены в объеме 0,4 мл. Таким образом, на примере сфероидов, образованных из 1000 клеток в каждом, 1,2 х 10 6 клеток в 0,4 мл приводит к плотности 3 × 10 6 клеток на мл. 1. Подготовка Микролунки получать клетки Микролуночные пластины являются стерильными, как это предусмотрено, и должны быть удалены только из упаковки в стерильной среде, такие как ламинарном шкафу биобезопасности. Стерильность следует поддерживать в течение протокола. Если бесплодие быть нарушена, лунки стерилизовать с помощью 70% этанола в воде с использованиемследующие дополнительные шаги. Добавляют 0,5 мл 70% этанола в каждого неиспользуемого скважины. Некоторые Микролунки будет пузырьки воздуха ловушки, хотя это может быть уменьшена путем добавления жидкости с одной стороны, и позволяет ему распространяться по всей поверхности, а не падать вертикально на поверхность. Замените крышку. Хотя паров этанола должны быстро проникают пузырьки, если Есть большое количество может быть желательно, чтобы удалить их. Центрифуга течение 2 мин при 2000 х г. Следует отметить, что важно обеспечить ротор должным образом сбалансированы на этой скорости. Использование низкого увеличения инвертированного микроскопа, проверяют пузырьки были удалены из лунок. Инкубировать в течение 5 мин с крышкой на при комнатной температуре. Аспирируйте этанол. Пластина может теперь быть промывают стерильной водой или PBS для немедленного использования или сушат на воздухе для хранения. Для того чтобы гарантировать, что клетки не взаимодействуют с поверхностью микропланшета, она может быть получена с использованием поверхностно-активное вещество. В целом эторекомендуется выполнить этот шаг на начальном этапе, и впоследствии сравнить сфероидов, созданные с и без ПАВ покрытием лунок. Добавить 0,5 мл промывки раствора в каждую лунку. Некоторые Микролунки будет пузырьки воздуха ловушки, хотя это может быть уменьшена путем добавления жидкости с одной стороны, и позволяет ему распространяться по всей поверхности, а не падать вертикально на поверхность. Замените крышку. Центрифуга течение 2 мин при 2000 х г для удаления пузырьков. Следует отметить, что важно обеспечить ротор должным образом сбалансированы на этой скорости. Использование низкого увеличения инвертированного микроскопа, проверяют пузырьки были удалены из лунок. Инкубировать в течение по крайней мере тридцати минут с крышкой на при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Пластины могут быть сохранены на четыре градуса с поверхностно раствора в лунках, пока не требуется, если должным образом герметизированы для предотвращения высыхания. Промыть пластины стерильной водой или PBS непосредственно перед использованием. Не позволяйте пластинывысыхать после нанесения покрытия. 2. Подготовка клетки ПРИМЕЧАНИЕ: Детали клеточного препарата будет несколько меняться в зависимости от конкретного типа клеток изучается. Однако мы наблюдали эти условия, чтобы быть эффективным с широким диапазоном ячеек, в том числе линий, обсуждаемых здесь, а также человека и мыши эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC), фибробласты, предполагаемого примитивной энтодермы, и стромальные клетки. Другие группы использовали эту систему успешно для широкого диапазона приложений, включая хондрогенезе из мезенхимальных стволовых клеток 9, стандартизированные поколение нейронных предшественников из плюрипотентных стволовых клеток 10, токсикологические анализы в гепатоцитах 11 и оценки спинного мозга регенерации в саламандры 12. Конкретный протокол для работы с клетками НТ29 показано здесь. Начните с T75 колбу клеток НТ29, культивируют в DMEM+ 10% FBS Аспирируйте ростовую среду из колбы, и добавить 3 мл трипсина. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С Остановить трипсина пищеварение, добавив 3 мл ростовой среды. Возьмите аликвоту для подсчета клеток и передать остаток в 15 мл трубки центрифуги. Центрифуга в течение 5 мин при 200 х г. В то время как центрифугирования в прогресс, подсчета клеток. Аспирируйте трипсин / средний смесь и заменить свежей средой роста, объеме, определяемом требуемой плотности клеток, рассчитанной выше. (По выбору) Pass клеточной суспензии через сито, чтобы удалить любые комки. ПРИМЕЧАНИЕ: условия уборки сотовый будет несколько отличаться между линиями. Если протокол для диссоциации например пассажей клеток, представляющих интерес имеется, который должен быть использован в качестве отправной точки. С чувствительные клеточных линий использовании трипсина может привести к чрезмерному гибели клеток. В этих случаях мы наблюдали хорошие результаты, используя TrypLE в качестве альтернативного dissociatiна реагентом 8. Если клетки становятся слипаются при диссоциации и теряют жизнеспособность, добавление ДНКазы к раствору фермента может решить эту проблему. Уменьшение времени диссоциации и используя шаг растирания, чтобы разбить комки клеток может также увеличить жизнеспособность. 3. Сфероид Формирование Примечание: сфероиды могут быть получены в различных средних составов, однако начальные испытания следует проводить с использованием среды, в которой клетки культивировали, чтобы отличить последствия перехода к 3-мерной системе культуры от последствий изменения состава среды. Добавить 0,4 мл ростовой среды в каждую лунку. Центрифуга течение 2 мин при 2000 х г для удаления пузырьков. Следует отметить, что важно обеспечить ротор должным образом сбалансированы с этой скоростью до центрифугирования. Использование низкого увеличения инвертированного микроскопа, проверяют пузырьки были удалены из лунок. Добавить 0,4 млсуспензию клеток при требуемой плотности (рассчитанной выше). Аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, без введения пузырьков воздуха в лунки. Важно, чтобы гарантировать, что клетки равномерно распределены по всей скважине, с тем чтобы получить последовательные сфероидов. Центрифуга в течение 5 мин при 200 х г. Если пластина не собственного уровня во время центрифугирования, конвекционные потоки могут возникнуть, в результате которых неравномерного распределения клеток через лунки. Таким образом, пластина должна быть сбалансирована внутри, так и против другой пластины, так, чтобы вес равномерно распределяется по обе стороны от несущей пластины. ПРИМЕЧАНИЕ: В случае отсутствия данных о неравномерности распределения клеток видно, это может быть необходимо нанести небольшое количество смазки на опорных точек на пластине носителя – проконсультироваться с центрифуги производителя для получения инструкций. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как клетки были центрифугировали в лунки, они достаточно сопроTant к вымыванию из незначительных движений пластины. Резких движений, которые приводят к выплескивания среды следует избегать, но передача пластины из центрифуги в микроскоп или инкубаторе не должны приводить к значительному смещению клеток. Использование инвертированного микроскопа, убедитесь, что клетки группируются в лунки, и чтобы они были равномерно распределены по скважине. Выдержите в течение ночи при 37 ° С Использование инвертированного микроскопа, наблюдать за процессом сфероида образования. Некоторые клеточные линии образуют компактные сфероидов в течение 24 часов, другие могут занять больше времени. Переход от кластера собираться в НТ29 показано на рисунке 2. Восстановление сфероидов из лунок и трансфер в суспензионной культуре, осторожно струйное их с помощью пипетки. С другой стороны, поддерживать сфероиды на месте со средой замены 8 – продолжительность зависит от их первоначального размера и темпов роста, которые четкостиИне время, пока они не перерастают микролунки, в котором они были сформированы. Для замены среды без потери сфероиды аспирации среды на краю хорошо с использованием пипетки Пастера. Медленно подносите вниз, пока она не начнет рисовать жидкость от мениска, и следуйте мениск вниз, как он падает. Затем добавляют свежую среду к стенке скважины в том же самом месте. Несколько сфероиды могут быть потеряны, поэтому если среда всегда отсасывали и заменяли на той же позиции, это число будет оставаться небольшой по сравнению с большими количествами в скважине.