マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

注：マイクロウェルプレートは、所望の結果に応じて、様々なフォーマットで提供されています。仕様および各フォーマットで使用されるべきであるセルの最小数と最大数のおおよその指針を表1に示す。小さいマイクロウェルは、鋭いポイントにテーパ、そしてスフェロイド間の変動は小さいサイズでより顕著になるが、このように全く下限サイズ制限は、ありません。わずか20個の細胞それぞれの平均からスフェロイドのルーチン生産は8簡単です。より大きなマイクロサイズが完全に先細りしていない、したがって、各マイクロウェル内の複数の小さな球状体を生じ得る少数の細胞からスフェロイドを形成しようとします。 AggreWell 400Exプレートを使用する際に、表面特性のわずかな違いのために、界面活性剤溶液（ステップ1.2）で準備はオプションではありません。 このプロトコルは、AggreWell 400プレートを使用することに基づいている – 他のフォーマットの短所のためULT 表1。各ウェルにロードされる細胞の数は、各スフェロイドのためにクラスタ化されるべき細胞の数で含有するマイクロウェルの数を掛けることによって決定される。例えば、個々に1000個の細胞からのスフェロイドを生成するために、各ウェル（1200スフェロイド回1,000細胞ごと=）1.2×10 6個の細胞をロードする必要があります。細胞密度は、細胞が0.4ミリリットルの容量でロードされることを考えると計算されなければならない。だから、1000個の細胞それぞれから形成されたスフェロイドの例については、0.4ミリリットル中に1.2×10 6個の細胞、1mlあたり3×10 6細胞の密度に変換されます。 1。セルを受信するための準備マイクロウェルマイクロウェルプレートは、提供されるように無菌であり、唯一のそのような層流バイオセーフティキャビネットなどの無菌環境でのパッケージから削除する必要があります。無菌性は、プロトコル全体で維持されるべきである。無菌性が損なわれるべきで、ウェルを用いて水中の70％エタノールを用いて再滅菌されているオプションの手順を実行します。 各未使用のウェルに70％エタノールの0.5ミリリットルを追加します。これは、一方の側に液体を加え、それが表面に広がるさせることなく、表面上に垂直にドロップすることによって低減することができるが、いくつかのマイクロウェルは、捕捉気泡う。蓋を交換してください。 エタノール蒸気を迅速に気泡を透過べきであるが、多数が存在する場合、それはそれらを除去することが望ましい場合がある。 2000 X gで2分間遠心。それは、ロータがこの速度で適切なバランスを確保することが重要であることに注意してください。 低倍率の倒立顕微鏡を使用して、ベリファイ気泡がマイクロウェルから除去されている。 室温での蓋の上で5分間インキュベートする。 吸引エタノール。プレートは、今すぐに使用できる無菌水又はPBSで洗浄し、又は保存のために空気乾燥させることができる。 細胞がマイクロウェル表面と相互作用しないことを確実にするためには、界面活性剤を用いて調製することができる。一般に、ある最初にこの手順を実行し、その後、界面活性剤でコーティングされたマイクロウェルとし、せずに生成されたスフェロイドを比較することをお勧め。 各ウェルにリンス溶液0.5mlを加える。これは、一方の側に液体を加え、それが表面に広がるさせることなく、表面上に垂直にドロップすることによって低減することができるが、いくつかのマイクロウェルは、捕捉気泡う。蓋を交換してください。 気泡を除去するために2000×gで2分間遠心分離する。それは、ロータがこの速度で適切なバランスを確保することが重要であることに注意してください。 低倍率の倒立顕微鏡を使用して、ベリファイ気泡がマイクロウェルから除去されている。 室温での蓋の上に、少なくとも30分間インキュベートするか、4℃で一晩適切に乾燥を防ぐために密封された場合に必要になるまで、プレートを、ウェル中の界面活性剤溶液で4℃で保存してもよい。 使用直前に無菌水またはPBSでプレートを洗浄してください。プレートを許可しないコー​​ティング後に乾燥させる。 2。細胞を調製 NOTE：細胞調製の詳細は検討されて特定の細胞型にいくらか変化するであろう。しかし、我々は、ここで説明ライン、ならびにヒトおよびマウス胚性幹細胞（ESC）、ヒト人工多能性幹細胞（IPSC）、線維芽細胞、推定上の原始内胚葉を含む細胞の広い範囲のに有効であることが、これらの状態を観察しているおよび間質細胞。他のグループは、間葉系幹細胞から軟骨9、多能性幹細胞10からの神経前駆体の標準化された生成を含む幅広い用途に成功し、このシステムを採用して、毒性学的には肝細胞11とサンショウウオ12における脊髄再生の評価に分析しています。 HT29細胞を操作するための特定のプロトコルはここに示されています。 中で培養、HT29細胞のT75フラスコで始まる+ 10％FBS 吸引成長フラスコから培地およびトリプシンの3ミリリットルを追加します。 37℃で5分間、細胞をインキュベート増殖培地3mlを添加することによってトリプシン消化を停止する。細胞計数のためにアリコートを取り、15ミリリットルの遠心管に残りを移す。 200×gで5分間遠心分離します。 遠心分離の進行中に、細胞を数える。 吸引トリプシン/培地混合し、上記のように計算量が必要な細胞密度で決まる、新鮮な増殖培地と交換してください。 （オプション）任意の塊を除去するために、ストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。注：細胞採取条件がラインの間に変動します。 例えば、目的の細胞を継代するための解離プロトコルが利用可能である場合、それは出発点として使用されるべきである。感受性細胞株は、トリプシンの使用では、過剰な細胞死をもたらし得る。これらのケースでは、我々は代替dissociatiとしてのTrypLEを用いて良好な結果を観察している試薬8に。細胞は、解離中に塊状になり、生存能力を失った場合、酵素溶液にDNA分解酵素を添加すると、これを解決することがあります。解離時間を短縮し、細胞塊を分割するチュレーションのステップを採用することも実行可能性を高めることができます。 3。回転楕円体の形成 NOTE：スフェロイドは、媒体の様々な製剤で生成することができる、しかし、初期の試験は、細胞が培地組成を変化させるの結果から、3次元培養系への移行の結果を区別するために、培養した培地を用いて行うべきである。 各ウェルに増殖培地の0.4ミリリットルを追加します。 気泡を除去するために2000×gで2分間遠心分離する。それは、ロータが遠心分離前、この速度で適切なバランスを確保することが重要であることに注意してください。 低倍率の倒立顕微鏡を使用して、ベリファイ気泡がマイクロウェルから除去されている。 0.4ミリリットルを追加（上記で計算）に必要な密度で細胞懸濁液。静かにマイクロウェルに気泡を導入することなく、上下にピペッティングにより混和する。これは、細胞が均一に一貫性スフェロイドを得るためには、ウェル全体に分散されることを保証することが重要である。 200×gで5分間遠心分離します。プレートは遠心分離中に自己のレベルをしない場合、対流はマイクロウェル全体の細胞の不均一な分布でその結果を生じることがある。重量がプレートキャリヤーの両側に均等に分配されるそのため、プレートは、ならびに他のプレートに対して内部的にバランスされるべきである。 注：不均一な細胞分布の証拠が見られた場合、それはプレートキャリア上のピボットポイントに潤滑少量を適用する必要があるかもしれない – 手順については、遠心分離機のメーカーに相談してください。 NOTE：細胞がマイクロウェル内に遠心分離されると、それらは合理的に抵抗であるプレートのマイナー動きから洗い流すに重要。培地スロッシングになり、急激な動きは避けなければならないが、遠心分離器から顕微鏡やインキュベーターにプレートの移動は、有意な細胞の変位を引き起こすべきではありません。 倒立顕微鏡を用いて、細胞がマイクロウェル内でクラスタ化され、それらが均等に十分に分散されていることをしていることを確認してください。 37℃で一晩インキュベートする。 倒立顕微鏡を用いて、スフェロイド形成過程を観察する。いくつかの細胞株は、他の人が時間がかかることがあり、24時間以内にコンパクトなスフェロイドを形成することになる。 HT29細胞中で凝集するクラスタからの進行は、 図2に示されている。 マイクロウェルからスフェロイドを回収し、静かにピペットでそれらを噴射することにより浮遊培養に移す。あるいは、培地交換8にその場でスフェロイドを維持する-継続時間は、それらの初期サイズおよび増殖速度に依存し、そのデフ彼らが形成されたマイクロウェルを脱却するまでの時間をINE。 パスツールピペットを用いてウェルの縁でスフェロイド、吸引媒体を失うことなく、メディアを交換してください。ゆっくりとそれはメニスカスから液体を引き出す始めるまでダウンして先端を持って、そしてそれが低下すると、メニスカスを下に従ってください。その後、同じ場所ではよく壁に新鮮な培地を追加します。いくつかのスフェロイドはメディアが常に吸引し、同じ位置に置き換えられている場合は、この数は十分に大きな数字と比較して小さいままになる、失われる可能性があります。