Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

NOTA: Piastre Elisa sono disponibili in diversi formati, a seconda dei risultati desiderati. Specifiche nonché le linee guida approssimativi per i numeri minimi e massimi di cellule che devono essere utilizzati con ogni formato sono mostrati nella Tabella 1. I pozzetti più piccoli cono di una punta acuminata, e quindi non vi è alcun limite di dimensione inferiore, anche se la variabilità tra sferoidi diventa più significativo a dimensioni più piccole. Produzione di routine di sferoidi da una media di appena 20 celle ciascuno è semplice 8. La dimensione micropozzetti più grande non è completamente rastremato, tenta quindi di formare sferoidi da un piccolo numero di cellule può causare diversi sferoidi più piccoli in ogni pozzetto. A causa di lievi differenze nelle proprietà di superficie, la preparazione con la soluzione di tensioattivo (punto 1.2) non è un optional quando si utilizza piastre AggreWell 400Ex. Questo protocollo si basa sull'uso di AggreWell 400 piastre – per altri formati consult Tabella 1. Il numero di celle da caricare in ogni pozzetto viene determinato moltiplicando il numero di micropozzetti contiene dal numero di celle da cluster per ogni sferoide. Ad esempio, per generare sferoidi di 1000 cellule a testa, ogni pozzetto deve essere caricato con (1.200 sferoidi volte 1.000 celle ciascuna =) 1,2 x 10 6 cellule. Densità cellulare deve essere calcolata dal momento che le cellule saranno caricati in un volume di 0,4 ml. Quindi per l'esempio di sferoidi formata da 1000 cellule ciascuno, 1,2 x 10 6 cellule in 0,4 ml traduce in una densità di 3 x 10 6 cellule per ml. 1. Micropozzetti prepararci a ricevere le celle Micropiastra sono sterili come previsto, e devono essere rimossi solo dalla confezione in un ambiente sterile come un armadio a flusso laminare biosicurezza. La sterilità deve essere mantenuta durante il protocollo. Sterilità dovrebbe essere compromessa, i pozzetti vengono risterilizzati utilizzando 70% di etanolo in acqua usando l'seguendo passaggi facoltativi. Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 70% in ciascun pozzetto inutilizzato. Alcuni pozzetti può intrappolare bolle d'aria, anche se questo può essere ridotta aggiungendo liquido su un lato, e permettendo di diffondersi attraverso la superficie, anziché cadere verticalmente sulla superficie. Rimettere il coperchio. Mentre vapore etanolo dovrebbe permeare rapidamente eventuali bolle, se ci sono grandi numeri può essere desiderabile per rimuoverli. Centrifugare per 2 minuti a 2000 x g. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità. Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti. Incubare per 5 min con il coperchio a temperatura ambiente. Aspirare etanolo. Piastra può essere lavato con acqua sterile o PBS per l'uso immediato, o aria essiccata per la conservazione. Al fine di garantire che le cellule non interagiscono con la superficie dei pozzetti, può essere preparato usando un tensioattivo. In generale èconsiglia di eseguire questo passaggio inizialmente, e successivamente confrontare sferoidi generati con e senza tensioattivi pozzetti rivestite. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di risciacquo ad ogni pozzetto. Alcuni pozzetti può intrappolare bolle d'aria, anche se questo può essere ridotta aggiungendo liquido su un lato, e permettendo di diffondersi attraverso la superficie, anziché cadere verticalmente sulla superficie. Rimettere il coperchio. Centrifugare per 2 min a 2000 xg per rimuovere le bolle. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità. Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti. Incubare per almeno trenta minuti con il coperchio a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. Piastre possono essere conservate a quattro gradi con la soluzione di tensioattivo nei pozzetti fino a quando necessario se adeguatamente sigillato per prevenire l'essiccazione. Lavare la piastra con acqua sterile o PBS immediatamente prima dell'uso. Non lasciare le piastread asciugare dopo il rivestimento. 2. Preparazione di cellule NOTA: I dettagli della preparazione cellulare variano un po 'con il tipo cellulare specifico oggetto di studio. Tuttavia abbiamo osservato queste condizioni per essere efficace con una vasta gamma di cellule, comprese le linee qui discussi, così come le cellule staminali embrionali umane e murine (ESC), le cellule staminali umane pluripotenti indotte (IPSC), fibroblasti, putativo endoderma primitivo, e le cellule stromali. Altri gruppi hanno impiegato con successo questo sistema per una vasta gamma di applicazioni, tra condrogenesi da cellule staminali mesenchimali 9, generazione standardizzata dei precursori neurali da cellule staminali pluripotenti 10, analisi tossicologiche in epatociti 11 e valutazione della rigenerazione del midollo spinale in salamandre 12. Il protocollo specifico per lavorare con le cellule HT29 è mostrato qui. Iniziare con un pallone T75 di cellule HT29, coltivate in DMEM+ 10% FBS Aspirare il terreno di crescita dal pallone, e aggiungere 3 ml di tripsina. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C. Smettere di tripsina digestione con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura. Prelevare un'aliquota per la conta cellulare e trasferire il resto in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 200 x g. Mentre la centrifugazione è in corso, contare le celle. Aspirare tripsina / medio impasto e sostituirlo con terreno di coltura fresco, volume determinato dalla densità cellulare richiesto calcolato sopra. (OPTIONAL) Passare la sospensione cellulare attraverso un colino per eliminare eventuali grumi. NOTA: condizioni di raccolta delle cellule variano un po 'tra le righe. Se un protocollo di dissociazione per es passaging le cellule di interesse è disponibile, che deve essere utilizzato come punto di partenza. Con linee cellulari sensibili uso di tripsina può portare alla morte delle cellule eccessivo. In questi casi abbiamo osservato buoni risultati utilizzando TrypLE come dissociati alternativail reagente 8. Se le cellule diventano clumped durante dissociazione e perdono vitalità, aggiunta di DNAsi alla soluzione enzima può risolvere questo. Ridurre i tempi di dissociazione e impiegando una fase di triturazione per rompere grumi di cellule può anche aumentare la redditività. 3. Formazione Spheroid NOTA: Spheroids possono essere generati in una varietà di formulazioni medie, studi tuttavia iniziali devono essere effettuate utilizzando il mezzo in cui le cellule sono state coltivate, per distinguere conseguenze di transizione a un sistema di coltura 3-dimensionale dalle conseguenze di vestiario composizione media. Aggiungere 0,4 ml di terreno di coltura in ciascun pozzetto. Centrifugare per 2 min a 2000 xg per rimuovere le bolle. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità prima della centrifugazione. Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti. Aggiungere 0,4 mlsospensione cellulare alla densità richiesta (calcolata sopra). Mescolare delicatamente pipettando su e giù, senza introdurre bolle d'aria nei pozzetti. È importante garantire che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il pozzetto, per ottenere sferoidi coerenti. Centrifugare per 5 min a 200 x g. Se la piastra non a livello di sé durante la centrifugazione, correnti di convezione possono sorgere quel risultato in distribuzione irregolare delle cellule di tutti i pozzetti. Pertanto, la piastra deve essere bilanciato internamente che contro l'altra piastra, in modo che il peso sia distribuito uniformemente su entrambi i lati della piastra portante. NOTA: Se la prova della distribuzione delle cellule irregolare è visto, può essere necessario applicare una piccola quantità di lubrificante ai punti di articolazione sul carrier plate – consultarsi con il produttore centrifuga per le istruzioni. NOTA: Una volta che le cellule sono state centrifugate nei pozzetti, sono ragionevolmente resistenzatante di dilavamento da movimenti minori della piastra. Movimenti bruschi che provocano sbattimento del mezzo dovrebbero essere evitati, ma il trasferimento della targa dal centrifuga al microscopio o incubatore non dovrebbero comportare lo spostamento delle cellule significativo. Utilizzando un microscopio invertito, verificare che le cellule hanno cluster all'interno dei pozzetti, e che sono distribuiti uniformemente in tutto il bene. Incubare una notte a 37 ° C. Utilizzando un microscopio invertito, osservare il processo di formazione sferoide. Alcune linee di cellule formeranno sferoidi compatti entro 24 ore, altri possono richiedere più tempo. La progressione da cluster per aggregare in cellule HT29 è mostrato in Figura 2. Recuperare sferoidi dai pozzetti e trasferire alla cultura sospensione da parte loro getto delicatamente con una pipetta. In alternativa, mantenere sferoidi in situ con medio sostituzione 8 – la durata dipende dalla loro dimensione iniziale e il tasso di crescita, che define il tempo fino a quando non diventano troppo i pozzetti in cui sono stati formati. Per sostituire medio senza perdere sferoidi, medio aspirare al bordo del pozzetto con una pipetta Pasteur. Lentamente portare la punta verso il basso fino a quando non comincia a disegnare liquido dal menisco, e seguire il menisco giù come il prezzo scende. Poi aggiungere mezzo fresco contro il muro ben nello stesso luogo. Qualche sferoidi possono essere persi, se medium è sempre aspirato e sostituito nella stessa posizione, questo numero rimarrà piccolo in confronto ai grandi numeri nel pozzo.