Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi
Summary
Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir.
Abstract
Tümör sferoidler giderek üç boyutlu olarak tümör hücrelerinin davranışı için önemli bir in vitro modeli olarak kabul edilmektedir. Daha fizyolojik ilgili geleneksel yapışık sayfalık kültürlere göre, onlar daha doğru karmaşıklığını ve gerçek tümörlerde mevcut etkileşimleri özetlemek. Daha iyi tümör biyolojisi, ya da yeni terapötik maddelerin etkinliğini değerlendirmek için, bu model koşum amacıyla, kontrollü bir şekilde ve önemli sayıda, yeniden üretilebilir sferoidler elde edebilmek için gereklidir.
AggreWell sistem tek bir hücre süspansiyonu santrifüj edilir içine piramit şeklinde bir mikro oyuk, yüksek yoğunluklu bir dizi oluşur. Hücrelerin sayısı, her kuyucuğa altındaki kümeleme, ve söz konusu farklı hücre tiplerinin sayısı ve oranı deneyi tarafından ortaya süspansiyonun özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Böylece, biz keyfi boyut ve kompozisyon tümör küremsiler üretebilirtemel platform teknolojisini değiştirmek gerek dışarı. Bu da kültür yüzey alanının santimetre karesi başına mikro oyuk yüzlerce son derece yüksek üretim seviyeleri, basit, nonlabor-yoğun bir işlem yoluyla elde edilebilir emin olun. Bu nedenle bu protokol tümör sfero alanındaki araştırmacılara geniş yararlı olacağını bekliyoruz.
Introduction
Tümör hücreleri daha fizyolojik ilgili sistem 1 için geçiş yaparken, geleneksel doku kültürü platformlarda belirlenen terapötik ajanlar etkinliğini kaybedebilir onlar zaman plastik kültüre yapmak daha üç boyutlu kültürlerde farklı davranırlar, delil artan bir vücudu var. Hem kendi temel biyoloji içgörü kazanmak için, bu şartlar altında kanser hücrelerinin davranışlarını incelemek için, ve aynı zamanda kliniğe tarama tesis yeni terapötik ajanlar geçme başarı oranını artırmak için istenmektedir. Uzun bir geçmişi olan biri, faydalı model sistemi tümörü küremsilerden 1,2 olarak bilinen kanser hücrelerinin üç boyutlu kümeler kullanır. İdeal olarak, küremsi oluşturulması için teknikler boyut ve bileşim deneyi tarafından kontrol edilir düzgün küremsi sayıda üretimini izin verebilir. Asılı bırak ve iyi plaka yaklaşır 3,4 bu yeniden bazı yerine getirmek mümküngerekliliklerine göre, verim genellikle sınırlıdır ve parçacıklarının çok sayıda nesil bir emek-yoğun bir görev haline gelir.
Biz son zamanlarda rejeneratif tıp alanında 5 benzer zorlukları çözmek için bir sistem geliştirdik. (Bkz. Şekil 1) yoğun bir şekilde mikron çaplı bir dizi kuyucuk içinde zorunlu toplanmasını istihdam, bu yaklaşım, çok sayıda hücre türleri 6 karışımları yanı sıra çeşitli biyomalzeme 7'nin dahil edilmesi de dahil olmak üzere hücre rasgele sayı, ikinci küremsiler üretilmesini sağlar. Bin ya da daha fazla yüz binlerce – – Küresel şekiller, çok sayıda teşkil edilir ve hemen özü ya da iki (yayınlanmamış gözlem) haftaya kadar en az bir 8 için ortam değişikliği ile oluşturulan edildiği mikro oyuk olarak muhafaza edilebilir. Bu sistem, bu nedenle de effe değerlendirilmesi için çok sayıda üniform ve tekrar tümör küremsiler üretimi için uygunduryeni anti-tümör maddeleri ya da temel biyolojik araştırmaların ctiveness.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu düzgün küremsi çok sayıda farklı kaynaklardan birden fazla hücre çizgilerinden elde edilebilir, böylece bir sistem kurduk. Biz, bu koşullar altında küremsilerin birlikte bir yapışkan hücre hattı karşılaşmaya henüz. Biz daha önce ancak bugüne kadar bu sorunu tümör hatları ile ortaya çıkmadı, anoikis 5,8 eğilimli popülasyonunda hücre kaybını gözlemledik. Sistem, 24-kuyu ve 6-çukurlu formatta, hem de şu anda geliştirilmekte olan mikro-50000 içeren her prototip biyoreaktörlerde mikro oyuk tutarlı davranışı ile, bir yüzey alanına sahip isteğe bağlı olarak ölçeklenebilir.
Asimetri bir endişe olabilir Sferoid olmalıdır, adım 4.8 'de inkübasyon süresi iki ya da üç gün artabilir. Sferoitler hususiyetlerini aynı zamanda, ancak bu durumda başka bir bakım wi temas küremsi gibi, yeterince düşük bir kültür yoğunlukları tutmak için alınması gereken, simetri artırmak için mikro oyuk ekstre sonra bir süre için inkübe edilebilirll genellikle daha büyük yapılar halinde sigorta. Bu nedenle, daha önce bu topaklar birincil sınırlamanın, sfero büyüklüğü olmak üzere, meydana edildiği mikro oyuk içinde kültürleri korumuştur. Bu da büyüme hızı ve başlangıç boyutu 8 hem de bir işlevi olduğunu ve mikro levha içinde uzatılmış kültür planlanan, bu önceden dikkate alınmalıdır. Büyümeyi engellemek için seçenekler, bu meydana gelirse, daha küçük bir küremsi başlayarak veya AggreWell 800 levhanın daha büyük mikro-kullanılarak ya da bulunmaktadır.
Spheroids zamanla tutarlılık artmaya başarısız olursa, bir potansiyel nedeni hücre ölümü olabilir. Özellikle yüksek metabolik olarak aktif hücrelerin daha büyük kümeler halinde, oksijen ve temel besin teslim toplu taşıma sınırlamalar bir nekrotik iç kısım 2 neden olabilir – böyle bir yapışkan olmayan küremsi sadece aşırı hücre ölümü bir sonucu olabilir. Alternatif olarak, mekanik YÖK ölçümlerisferoitlerin sion, belirli bir hücre hattı 13'ün metastaz potansiyeli ile ilişkisi, hücreler arası bağlayıcı güçleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu belki de bu tür alan oranına yuvarlaklık ve çevre gibi morfometrik parametreleri kullanarak, sfero şekil ve metastatik potansiyeli arasındaki ilişkiyi araştırmak ilginç olurdu.
Küremsiler mekanik ve morfometrik özelliklerini incelemek, ek olarak, mikro sisteminde montaj birden fazla hücre tipleri ve / veya biyomalzeme 6,7 kombinasyonlarından oluşan, karma bileşim küremsi büyük ölçekli üretimine izin verir. Diğer hücre tipleri ile tümör hücrelerinin etkileşimleri bu nedenle, örneğin, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile kombinasyon halinde tümör hücrelerinden sferoidler elde etmek için ilgi çekici olabilir, daha yakından 14 in vivo tümörlerin davranış modeli için önemlidir. Çeşitli biyomalzeme Mikropartiküller da dahil edilebilir ve SPH etkileyebilirdoğrudan hücre 7,15 ve ayrıca küremsi 16 içine büyüme faktörleri ve sitokinlerin kontrollü serbest bırakılması için rezervuar olarak ile etkileşimler yoluyla hem eroid özellikleri.
Kısırlık konusunda herhangi bir ilgi vardır Bir önceki deneyin bir parçası olarak, bir kuluçka makinesi içinde bir zaman harcanan bazı oyuklar daha önce kullanılmış olan bir mikro levha ile çalışırken, örneğin oyuklar,% 70 etanol ile sterilize edilebilir su.
Küreler, bir kez oluştuktan sonra, aynı zamanda bir hücre süzgecinden fazla süspansiyon geçirilmesiyle kalıntı adi hücrelerden ayrılabilir. Sferoidler muhafaza olacak ise tek tek hücreler, geçecek. Küremsi kültür boyunca, potansiyel olarak metastatik hücrelerin dökülme şüphesi varsa, bu işlem birkaç defa gerçekleştirmek istenebilecektir – ilk adi hücreleri çıkarmak için, ve daha sonra saflaştırıldı ve izole etmek içinHücrelerin d popülasyonları sferoitler tarafından verilen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Dr Ungrin için yeni bir araştırmacı start-up hibe altında, Calgary Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
| Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
| Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
| PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
| Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
| DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
| FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
| TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
| Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
| Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |
References
- Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids. Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).
- Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Bauwens, C. L., Song, H., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).
- Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).
- Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).
- Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line. Toxicological Sciences. , (2012).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Butler, C. M., Foty, R. A. Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry. J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).
- Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture. J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).
- Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).
- Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development. Biomaterials. , (2012).
