Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

HINWEIS: Die Mikrotiterplatten werden in verschiedenen Formaten, je nach den gewünschten Ergebnissen. Spezifikationen sowie ungefähre Leitlinien für die minimale und maximale Anzahl von Zellen, die mit jedem Format verwendet werden soll, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die kleineren Kavitäten verjüngen sich zu einer scharfen Spitze, und somit gibt es keine Größenbeschränkung niedriger, wenngleich Variabilität zwischen den Sphäroiden wird bei kleineren Größen mehr an Bedeutung. Routinemäßige Produktion von Sphäroiden von durchschnittlich weniger als 20 Zellen je 8 ist unkompliziert. Die größere Mikrowell-Größe ist nicht vollständig verjüngt, versucht daher zu Sphäroiden aus einer kleinen Anzahl von Zellen bilden können, in mehrere kleinere Kügelchen in jeder Vertiefung führen. Durch geringe Unterschiede in der Oberflächeneigenschaften, die Vorbereitung mit der Tensid-Lösung (Schritt 1.2) ist nicht optional, wenn Sie AggreWell 400Ex Platten. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von AggreWell 400 Platten auf Basis – für andere Formate Nachteileult Tabelle 1. Die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung beladen ist, wird durch Multiplizieren der Anzahl der Vertiefungen und durch die Anzahl der Zellen, die für jeden Cluster-Sphäroid enthält bestimmt. Zum Beispiel, um Sphäroide von 1000 Zellen pro Stück zu erzeugen, muß jede Vertiefung (1.200 mal 1.000 Zellen Sphäroide jeweils =) 1,2 x 10 6 Zellen geladen werden. Gegeben, dass die Zellen in einem Volumen von 0,4 ml eingelegt werden muß Zelldichte berechnet werden. So zum Beispiel von Sphäroiden von jeweils 1000 Zellen gebildet wird, 1,2 x 10 6 Zellen in 0,4 ml entspricht einer Dichte von 3 × 10 6 Zellen pro ml enthält. 1. Vorbereiten Mikroschälchen in Zellen erhalten Microwell Platten sind steril, wie vorgesehen, und sollte nur aus der Verpackung in einer sterilen Umgebung wie einem Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank entfernt werden. Sterilität sollte in der gesamten Protokoll beibehalten werden. Die Sterilität beeinträchtigt werden, werden die Vertiefungen mit 70% Ethanol in Wasser unter Verwendung der erneut sterilisiertfolgenden optionalen Schritte. 0,5 ml 70% igem Ethanol zu jeder ungenutzte gut. Einige Mikrovertiefungen werden Lufteinschlüsse, obwohl dies kann durch Zugabe von Flüssigkeit auf der einen Seite, und ermöglicht es, über die Oberfläche verteilt, anstatt abzufallen senkrecht auf die Oberfläche reduziert werden. Deckel wieder. Während Ethanoldampf sollte schnell alle Blasen durchdringen, wenn es eine große Anzahl kann es wünschenswert sein, sie zu entfernen. Zentrifuge für 2 min bei 2.000 x g. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit ausgeglichen. Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. Inkubation für 5 min bei geschlossenem Deckel bei Raumtemperatur. Saugen Ethanol. Platte kann nun mit sterilem Wasser oder PBS für die sofortige Verwendung gewaschen werden, oder für die Lagerung an der Luft getrocknet. Um zu gewährleisten, dass die Zellen nicht mit der Oberfläche wechselwirken Mikrotiterplatten, kann es unter Verwendung eines Tensids hergestellt werden. Im allgemeinen ist esempfiehlt sich, diesen Schritt selbst durchführen und anschließend vergleichen Sphäroiden mit und ohne Tensid-beschichtete Kavitäten erzeugt. In 0,5 ml Spüllösung in jede Vertiefung. Einige Mikrovertiefungen werden Lufteinschlüsse, obwohl dies kann durch Zugabe von Flüssigkeit auf der einen Seite, und ermöglicht es, über die Oberfläche verteilt, anstatt abzufallen senkrecht auf die Oberfläche reduziert werden. Deckel wieder. Zentrifugieren für 2 min bei 2.000 × g, um Blasen zu entfernen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit ausgeglichen. Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. Inkubation für mindestens dreißig Minuten mit dem Deckel auf bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Platten können bei vier Grad mit der Tensid-Lösung in die Vertiefungen erst benötigt, wenn ordnungsgemäß verschlossen austrocknen gespeichert werden. Waschen Sie Platte mit sterilem Wasser oder PBS unmittelbar vor der Verwendung. Platten nicht zulassenAustrocknen nach der Beschichtung. 2. Vorbereiten Cells HINWEIS: Die Details der Zellpräparation wird etwas mit der spezifischen Zelltyp untersucht variieren. Allerdings haben wir diese Bedingungen beobachtet wirksam mit einer breiten Palette von Zellen, einschließlich der Linien hier diskutiert sowie humanen und murinen embryonalen Stammzellen (ESC), der Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), Fibroblasten, vermeintliche primitive Endoderm sein, und Stromazellen. Andere Gruppen haben dieses System erfolgreich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Chondrogenese aus mesenchymalen Stammzellen 9 eingesetzt, standardisierte Generation von neuralen Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen 10, analysiert toxikologischen in Hepatozyten 11 und Beurteilung der Rückenmarksregeneration in 12 Salamander. Das spezifische Protokoll für die Arbeit mit HT29-Zellen wird hier gezeigt. Beginnen Sie mit einem T75-Kolben von HT29 Zellen in DMEM+ 10% FBS Saugen Wachstumsmedium von der Flasche, und 3 ml Trypsin. Zellen 5 min bei 37 ° C. Stoppen Trypsin Verdauung durch Zugabe von 3 ml Wachstumsmedium. Einen aliquoten zur Zellzählung und übertragen Sie den Rest in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. Während der Zentrifugation im Gange ist, zählen Zellen. Saugen Trypsin / Medium-Gemisch und ersetzen mit frischem Wachstumsmedium, das Volumen durch die erforderliche Zelldichte wie oben berechnet bestimmt. (Optional) Führen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb, um eventuelle Klumpen zu entfernen. HINWEIS: Zellerntebedingungen wird etwas zwischen den Zeilen variieren. Wenn ein Protokoll für die Dissoziation zB Passagieren der Zellen von Interesse ist, sollte diese als Ausgangspunkt verwendet werden. Bei empfindlichen Zelllinien Verwendung von Trypsin kann in übermäßigen Zelltod führen. In diesen Fällen haben wir gute Ergebnisse beobachtet mit TrypLE als Alternative dissociatiReagenz auf acht. Wenn die Zellen während der Dissoziation verklumpten und verlieren die Lebensfähigkeit kann die Zugabe von DNAse der Enzymlösung dieses Problem zu beheben. Reduzierung Dissoziation Zeiten und Einsatz eines Verreiben Schritt zu brechen Zellklumpen kann auch erhöhen Rentabilität. 3. Sphäroidbildung HINWEIS: Sphäroide können in einer Vielzahl von Formulierungen Medium erzeugt werden, aber die ersten Versuche sind nach dem Medium, in dem die Zellen kultiviert wurden, um Folgen der Übergang zu einem 3-dimensionalen Kultursystem von Folgen der Änderung der Zusammensetzung des Mediums unterscheiden, durchgeführt werden. Hinzufügen von 0,4 ml Wachstumsmedium in jede Vertiefung. Zentrifugieren für 2 min bei 2.000 × g, um Blasen zu entfernen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit vor der Zentrifugation ausgewogen. Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. In 0,4 mlZellsuspension mit der erforderlichen Dichte (oben berechnet). Vorsichtig mischen durch Pipettieren von oben und unten, ohne dabei Luftblasen in die Vertiefungen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den gut verteilt, um eine einheitliche Kügelchen zu erhalten. Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. Wenn die Platte nicht selbst Niveau während der Zentrifugation kann Konvektionsströme dieses Ergebnis in ungleichmäßige Verteilung der Zellen in die Vertiefungen entstehen. Daher sollte die Platte nach innen und gegen die andere Platte ausgeglichen werden, so dass das Gewicht gleichmäßig auf beide Seiten der Trägerplatte verteilt sind. HINWEIS: Wenn Hinweise auf unebenen Zellverteilung zu sehen ist, kann es notwendig sein, eine kleine Menge der Schmierung der Drehpunkte auf der Platte Träger gelten – konsultieren Zentrifugenhersteller für Anweisungen. HINWEIS: Sobald die Zellen in die Vertiefungen zentrifugiert wurden, sind sie einigermaßen Widerstandtig, Auswaschen von geringfügigen Bewegungen der Platte. Abrupte Bewegungen, die in Schwappen des Mediums führen sollte vermieden werden, aber Transfer von der Platte aus der Zentrifuge an Mikroskop oder Inkubator sollte nicht in signifikanten Zell Verschiebung führen. Mit einem inversen Mikroskop sicher, dass Zellen in die Kavitäten gruppierten, und dass sie gleichmäßig über die gut verteilt. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. Mit einem inversen Mikroskop beobachten den Prozess der Sphäroid-Bildung. Einige Zelllinien kompakten Kügelchen innerhalb von 24 Stunden zu bilden, andere können länger dauern. Die Progression von Cluster in HT29-Zellen aggregieren, ist in Fig. 2 gezeigt. Recover Sphäroiden aus den Kavitäten und Transfer zum Suspensionskultur durch vorsichtiges Strahlen sie mit einer Pipette. Alternativ halten Sphäroiden in situ mit Mediumwechsel 8 – die Dauer hängt von ihrer ursprünglichen Größe und Wachstumsrate, die define der Zeit, bis sie die Vertiefungen, in denen sie gebildet wurden hinauswachsen. Um mittel, ohne Sphäroiden, absaugen Medium am Rand des Brunnens mit einer Pasteurpipette ersetzen. Langsam bringen die Spitze nach unten, bis es beginnt, Flüssigkeit aus dem Meniskus zu ziehen, und folgen Sie den Meniskus nach unten, wie es fällt. Dann fügen Sie frisches Medium gegen die Wand und an der gleichen Stelle. Einige Sphäroide können verloren werden, wenn jedoch Medium abgesaugt und immer in derselben Position ersetzt wird, wird diese Zahl klein im Vergleich zu der großen Zahl im Bohrloch verbleiben.