La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

NOTA: placas de micropocillos están disponibles en diferentes formatos, dependiendo de los resultados deseados. Especificaciones así como directrices aproximadas para el número mínimo y máximo de las células que se deben utilizar con cada formato se muestran en la Tabla 1. Los micropocillos más pequeños se estrechan a un punto agudo, por lo que no hay límite de tamaño menor, aunque la variabilidad entre los esferoides se hace más significativa en tamaños más pequeños. La producción rutinaria de esferoides de un promedio de tan sólo 20 células cada uno es directo 8. El tamaño más grande de micropocillos no es completamente cónica, por lo tanto, los intentos de formar esferoides de pequeños números de células puede resultar en múltiples esferoides más pequeñas en cada micropocillo. Debido a ligeras diferencias en las propiedades de la superficie, con la preparación de la solución de tensioactivo (paso 1.2) no es opcional cuando se utiliza placas AggreWell 400EX. Este protocolo se basa en el uso de placas de AggreWell 400 – para otros formatos de contrasULT Tabla 1. El número de células que se cargan en cada pocillo se determina multiplicando el número de micropocillos que contiene el número de células que se agrupan para cada esferoide. Por ejemplo, para generar esferoides de 1000 células cada uno, cada pocillo se debe cargar con esferoides (1200 veces 1000 células cada uno) = 1,2 x 10 6 células. La densidad celular debe calcularse teniendo en cuenta que las células se cargan en un volumen de 0,4 ml. Así que para el ejemplo de esferoides formados a partir de 1000 células cada uno, 1,2 x 10 6 células en 0,4 ml se traduce en una densidad de 3 x 10 6 células por ml. 1. Los micropocillos se preparan para recibir las células Microplacas son estériles como siempre, y sólo deben ser retirados de sus envases en un ambiente estéril, tal como un gabinete de bioseguridad de flujo laminar. La esterilidad se debe mantener durante todo el protocolo. En caso de que se vea comprometida la esterilidad, los pocillos se esterilizarse utilizando etanol al 70% en agua usando ellos siguientes pasos opcionales. Añadir 0,5 ml de etanol al 70% a cada pocillo no utilizada. Algunos micropocillos se atrapar burbujas de aire, aunque esto se puede reducir mediante la adición de líquido a un lado, y permitiendo que se propague a través de la superficie, en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Vuelva a colocar la tapa. Mientras que el vapor de etanol debe impregnar rápidamente cualquier burbuja, si hay un gran número puede ser conveniente para eliminarlos. Centrifugar durante 2 min a 2.000 x g. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad. El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos. Incubar durante 5 minutos con la tapa en a temperatura ambiente. Aspirar el etanol. Placa ahora se puede lavar con agua estéril o PBS para su uso inmediato, o se seca al aire para el almacenamiento. Con el fin de asegurar que las células no interactúan con la superficie de micropocillos, se puede preparar usando un agente tensioactivo. En general, esaconsejable realizar este paso inicialmente, y posteriormente comparar esferoides generados con y sin tensioactivos micropocillos recubiertos. Añadir 0,5 ml de solución de lavado a cada pocillo. Algunos micropocillos se atrapar burbujas de aire, aunque esto se puede reducir mediante la adición de líquido a un lado, y permitiendo que se propague a través de la superficie, en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Vuelva a colocar la tapa. Centrifugar durante 2 min a 2000 xg para eliminar las burbujas. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad. El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos. Se incuba durante al menos treinta minutos con la tapa puesta, a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. Las placas pueden ser almacenados a cuatro grados con la solución de tensioactivo en los pocillos hasta que se necesite si está sellado adecuadamente para evitar que se sequen. Lavar la placa con agua estéril o PBS inmediatamente antes de su uso. No permita que las placasa secarse después del revestimiento. 2. Preparación de células NOTA: Los detalles de la preparación celular variarán algo con el tipo específico de célula en estudio. Sin embargo, hemos observado estas condiciones para ser eficaz con una amplia gama de células, incluidas las líneas discutidas aquí, así como las células madre embrionarias humanas y murinas (ESC), células madre pluripotentes inducidas humanas (IPSC), fibroblastos, endodermo primitivo putativo, y células del estroma. Otros grupos han utilizado este sistema con éxito para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la condrogénesis de células madre mesenquimales 9, generación normalizada de los precursores neuronales a partir de células madre pluripotentes 10, análisis toxicológicos en hepatocitos 11 y la evaluación de la regeneración de la médula espinal en salamandras 12. El protocolo específico para trabajar con células HT29 se muestra aquí. Comience con un frasco T75 de células HT29, se cultivaron en DMEM+ 10% de FBS Aspirar medio de crecimiento del frasco, y añadir 3 ml de tripsina. Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C. Detener la digestión de tripsina mediante la adición de 3 ml de medio de crecimiento. Tomar una alícuota para el recuento de células y transferir el resto en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 200 x g. Mientras que la centrifugación está en curso, contar las células. Tripsina Aspirar / mezcla de medio y reemplazar con medio de crecimiento fresco, volumen determinado por la densidad celular obligatorio calculado anteriormente. (OPCIONAL) Pase la suspensión de células a través de un colador para eliminar los grumos. NOTA: las condiciones de cosecha celular varían un poco entre líneas. Si un protocolo de disociación para, por ejemplo pasar las células de interés está disponible, que se debe utilizar como punto de partida. Con las líneas celulares sensibles uso de tripsina puede resultar en la muerte celular excesiva. En estos casos hemos observado buenos resultados usando TrypLE como dissociati alternativaen reactivo 8. Si las células se vuelven agrupada durante la disociación y pierden viabilidad, la adición de DNasa a la solución de enzima puede resolver este. Reducir los tiempos de disociación y el empleo de un paso de trituración para romper los agregados celulares también puede aumentar la viabilidad. 3. Formación esferoide NOTA: Los esferoides pueden generarse en una variedad de formulaciones de medio, sin embargo los ensayos iniciales deben llevarse a cabo usando el medio en el que las células se cultivaron, para distinguir consecuencias de la transición a un sistema de cultivo de 3 dimensiones de las consecuencias de los cambios en la composición del medio. Añadir 0,4 ml de medio de crecimiento a cada pocillo. Centrifugar durante 2 min a 2000 xg para eliminar las burbujas. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad antes de la centrifugación. El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos. Añadir 0,4 mlsuspensión de células a la densidad requerida (calculada anteriormente). Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo, sin la introducción de burbujas de aire en los micropocillos. Es importante asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente por todo el pozo, con el fin de obtener esferoides consistentes. Centrifugar durante 5 min a 200 x g. Si la placa no se hace a nivel de auto durante la centrifugación, las corrientes de convección Puede ocurrir que en la distribución desigual de las células a través de las cúpulas. Por lo tanto, la placa debe ser equilibrado internamente, así como en contra de la otra placa, de manera que el peso se distribuye uniformemente a ambos lados de la placa de soporte. NOTA: Si no se observa evidencia de la distribución desigual de células, puede ser necesaria la aplicación de una pequeña cantidad de la lubricación de los puntos de giro en el soporte de la placa – consultar con el fabricante de la centrífuga para obtener instrucciones. NOTA: Una vez que las células han sido centrifugada en los micropocillos, que son razonablemente resistenciatante del lavado a fondo de los movimientos menores de la placa. Movimientos bruscos que resultan en chapoteo del medio deben ser evitados, pero la transferencia de la placa de centrífuga al microscopio o una incubadora no deberían resultar en el desplazamiento celular significativa. Usando un microscopio invertido, compruebe que las células se han agrupado dentro de los pocillos, y que se distribuyen de forma homogénea en el pozo. Incubar toda la noche a 37 ° C. Usando un microscopio invertido, observar el proceso de la formación de esferoides. Algunas líneas de células se forman esferoides compactos dentro de las 24 horas, otros pueden tardar más tiempo. La progresión de clúster a agregarse en las células HT29 se muestra en la Figura 2. Recuperar esferoides de los micropocillos y traslado al cultivo en suspensión por chorro suavemente con una pipeta. Alternativamente, mantener esferoides in situ con reemplazo de medio 8 – la duración depende de su tamaño inicial y la tasa de crecimiento, que defINE el tiempo hasta que se superan los micropocillos en el que se formaron. Para reemplazar medio sin perder esferoides, medio aspirado en el borde del pozo utilizando una pipeta Pasteur. Lentamente la punta hacia abajo hasta que comience a dibujar líquido del menisco, y siga el menisco hacia abajo a medida que cae. A continuación, añadir medio fresco contra la pared del pozo en el mismo lugar. Unos pocos esferoides pueden perderse, sin embargo si el medio siempre se aspiró y se reemplazó en la misma posición, este número seguirá siendo pequeña en comparación con los grandes números en el pozo.