ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

הערה: צלחות microwell זמינות בפורמטים שונים, בהתאם לתוצאות הרצויות. מפרט כמו גם הנחיות משוערת למספרי המינימום ומקסימום של תאים שיש להשתמש בכל תבנית מוצגים בטבלה 1. Microwells הקטן יותר להתחדד לנקודה חדה, ולכן אין מגבלת גודל נמוכה יותר, אם כי שונה בין הספרואידים הופך להיות יותר משמעותי בגדלים קטנים יותר. ייצור שיגרתי של הספרואידים מממוצע קטן כמו 20 תאים כל אחד הוא 8 פשוטים. גודל microwell הגדול אינו מחודד באופן מלא, ולכן מנסה ליצור הספרואידים ממספר קטן של תאים עלולים לגרום להספרואידים קטנים מרובים בכל microwell. בשל הבדלים קלים במאפייני שטח, הכנה עם הפתרון פעילי שטח (שלב 1.2) היא לא אופציונלית בעת שימוש בצלחות AggreWell 400Ex. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש ב400 צלחות AggreWell – לחסרונות פורמטים אחריםלוח ult 1. מספר התאים להיות טעונים בכל טוב נקבע על ידי הכפלת מספר microwells הוא מכיל במספר התאים שהתקבצו לכל אליפטית. לדוגמה, כדי ליצור הספרואידים מ1000 תאים כל אחד, כל אחד גם חייב להיות עמוס (1,200 הספרואידים פעמים 1,000 תאים כל אחד =) 1.2 x 10 6 תאים. צפיפות תאים חייבת להיות מחושבת בהתחשב בכך שיהיו טעונים התאים בנפח של 0.4 מיליליטר. אז עבור הדוגמא של הספרואידים נוצרו מ1000 תאים כל אחד, 1.2 x 10 6 תאים ב0.4 מיליליטר מתרגם את צפיפות של 3 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. 1. Microwells הכנה לקבלת תאים צלחות microwell הן סטרילי, כפי שנקבע, ויש להסירם רק מהאריזה שלהם בסביבת סטרילית, כגון ארון מינרית זרימת בטיחות ביולוגי. עקרות צריכה להישמר לאורך כל הפרוטוקול. צריכים עקרות להיות בסכנה, בארות resterilized באמצעות 70% אתנול במים באמצעותביצוע שלבים אופציונליים. הוסף 0.5 מיליליטר של אתנול 70% לכל טוב שאינו בשימוש. microwells כמה יהיה בועות אוויר מלכודת, אם כי זה יכול להיות מופחת על ידי הוספת נוזלים בצד אחד, ומאפשר לו להתפשט על פני השטח, ולא שמטו אותו בצורה אנכית על גבי המשטח. החלפת מיכסה. בעוד אדי אתנול צריכים לחדור במהירות כל בועות, אם יש מספרים גדולים זה עשוי להיות רצוי כדי להסיר אותם. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 2,000 x גרם. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו. בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. דגירה במשך 5 דקות עם המכסה על בטמפרטורת חדר. לשאוב אתנול. צלחת החברה ניתן לשטוף עם מים סטריליים או PBS לשימוש מיידי, או אוויר יבש לאחסון. על מנת להבטיח שתאים אינם אינטראקציה עם פני השטח microwell, זה עשוי להיות מוכן באמצעות פעילי שטח. באופן כללי זהמומלץ לבצע שלב זה בתחילה, ולאחר מכן להשוות הספרואידים שנוצרו עם ובלי microwells מצופה פעילי שטח. הוסף 0.5 מיליליטר של שטיפת פתרון היטב כל אחד. microwells כמה יהיה בועות אוויר מלכודת, אם כי זה יכול להיות מופחת על ידי הוספת נוזלים בצד אחד, ומאפשר לו להתפשט על פני השטח, ולא שמטו אותו בצורה אנכית על גבי המשטח. החלפת מיכסה. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,000 XG כדי להסיר בועות. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו. בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. דגירה של לפחות חצי שעה עם המכסה על בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. צלחות עשויות להיות מאוחסנות בארבע מעלות עם הפתרון פעילי שטח בבארות עד צורך אם אטום כראוי כדי למנוע התייבשות. לשטוף צלחת עם מים סטריליים או PBS לפני מייד לשימוש. אל תאפשר צלחותלהתייבש לאחר ציפוי. 2. הכנת תאים הערה: הפרטים של הכנת תא ישתנו במקצת עם נחקר סוג תא המסוים. עם זאת יש לנו ציינו בתנאים אלה על מנת להיות יעילים עם מגוון רחב של תאים, כוללים הקווים שנדונו כאן, כמו גם בתאי גזע עובריים אנושיים ועכבריים (ESC), תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC), fibroblasts, האנדודרם פרימיטיווי משוער, ותאי סטרומה. קבוצות אחרות יש מועסקים במערכת זו בהצלחה עבור מגוון רחב של יישומים, כולל chondrogenesis מתאי גזע mesenchymal 9, דור הסטנדרטי של מבשרים עצביים מתאי גזע pluripotent 10, טוקסיקולוגי מנתח בhepatocytes 11 והערכה של התחדשות בחוט השדרה בסלמנדרות 12. הפרוטוקול הספציפי לעבודה עם תאי HT29 מוצג כאן. התחל עם בקבוק T75 של תאי HT29, בתרבית DMEM+ 10% FBS לשאוב בינוני צמיחה מבקבוק, ולהוסיף 3 מיליליטר של טריפסין. דגירה תאים למשך 5 דקות על 37 ° C. תפסיק עיכול טריפסין על ידי הוספת 3 מיליליטר של מדיום גידול. קח aliquot לספירת תאים ולהעביר את השארית לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב200 x גרם. בעוד צנטריפוגה היא בהתקדמות, לספור תאים. טריפסין לשאוב / תערובת בינונית ולהחליף עם מדיום גידול טרי, נקבע על פי נפח צפיפות התאים הנדרש כפי שמחושב לעיל. (אופציונלי) לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת על מנת להסיר כל גושים. הערה: תנאי קצירה נייד ישתנו מעט בין השורות. אם פרוטוקול דיסוציאציה לדוגמא passaging התאים של עניין זמין, שאמור לשמש כנקודת התחלה. עם שימוש בשורות תאים רגישים של טריפסין עלול לגרום למוות של תאים מופרזים. במקרים אלה יש לנו ציינו תוצאות טובות באמצעות TrypLE כdissociati אלטרנטיביעל מגיב 8. אם התאים הופכים בכבדים במהלך ניתוק ולאבד את יכולת הקיום, תוספת של DNAse לפתרון האנזים עשויה לפתור בעיה זו. צמצום זמני ניתוק והעסקת צעד טחינה דקה כדי לשבור את גושי תא יכול גם להגביר את הכדאיות. 3. כינונה אליפטית הערה: spheroids עלול להיווצר במגוון של ניסוחים בינוניים, צריכים להתבצע ניסויים ראשוניים זאת תוך שימוש במדיום שבו התאים בתרבית, כדי להבדיל את ההשלכות של מעבר למערכת תרבות 3 ממדים מהשלכות של שינוי הרכב בינוני. הוספת 0.4 מיליליטר של מדיום גידול היטב כל אחד. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,000 XG כדי להסיר בועות. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו לפני צנטריפוגה. בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. הוספת 0.4 מיליליטרהשעיה תא בצפיפות הנדרשת (מחושב לעיל). לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, ללא החדרת בועות אוויר אל תוך microwells. זה חשוב כדי להבטיח שהתאים מתחלקים באופן שווה לאורך כל טוב, על מנת לקבל הספרואידים עקביים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב200 x גרם. אם הצלחת לא ברמה עצמית במהלך צנטריפוגה, זרמי הסעה עלולים להתעורר תוצאה שבחלוקה לא שווה של תאים על פני microwells. לכן, הצלחת צריכה להיות מאוזנת באופן פנימי, כמו גם על הצלחת אחרת, כך שהמשקל מחולק באופן שווה על שני הצדדים של ספק הצלחת. שים לב: אם ראיות של חלוקת תא אחידה נראית, זה עשוי להיות נחוץ כדי להחיל כמות קטנה של שימון לנקודות הציר בספק צלחת – להתייעץ עם יצרן צנטריפוגות לקבלת הוראות. הערה: ברגע שהתאים כבר centrifuged לmicrowells, הם מתנ סבירtant לכביסה מ תנועות קלות של הצלחת. יש להימנע מתנועות פתאומיות שתגרומנה ניפוצים בינוניים, אבל ההעברה של הצלחת מצנטריפוגות למיקרוסקופ או חממה לא צריכה לגרום לתזוזה של תאים משמעותיים. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ודא כי תאים שהתקבצו בתוך microwells, ושהם מחולקים באופן שווה על פני הבאר. דגירה הלילה בשעה 37 ° C. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, לצפות בתהליך של היווצרות אליפטית. שורות תאים מסוימות יהוו הספרואידים קומפקטיים בתוך 24 שעות, אחרים עשויים להימשך זמן רב יותר. ההתקדמות מאשכול כדי לצבור בתאי HT29 מוצגת באיור 2. לשחזר הספרואידים מmicrowells ולהעביר לתרבות השעיה בעדינות על ידי jetting אותם עם טפטפת. לחלופין, לשמור הספרואידים באתרו עם החלפה בינונית 8 – משך הזמן תלוי בגודלם הראשוני ושיעור צמיחה, אשר define הזמן עד שהם מתגברים על microwells שבו הם נוצרו. כדי להחליף בינוני מבלי לאבד הספרואידים, בינוניים לשאוב בקצה של באר בעזרת פיפטה פסטר. לאט לאט מביא את הקצה למטה עד שהוא מתחיל לצייר נוזל מהמניסקוס, ובצע את המניסקוס למטה כפי שהוא יורד. לאחר מכן להוסיף בינוני טרי על הקיר גם באותו המקום. כמה הספרואידים עלולים ללכת לאיבוד, אך אם מדיום הוא תמיד נשאף, והוחלף באותה התנוחה, את המספר הזה יישאר קטן בהשוואה למספרים הגדולים בבאר.