إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

ملاحظة: هي لوحات Microwell متوفرة في أشكال مختلفة، اعتمادا على النتائج المرجوة. وتظهر المواصفات فضلا عن المبادئ التوجيهية تقريبي للأرقام الحد الأدنى والحد الأقصى من الخلايا التي ينبغي أن تستخدم مع كل شكل في الجدول 1. وmicrowells أصغر تفتق إلى نقطة حادة، وبالتالي ليس هناك حد أدنى حجم، على الرغم من التباين بين الأجسام الشبه الكروية يصبح أكثر أهمية في أحجام أصغر. الإنتاج الروتيني للالكروية من متوسط ​​اقل من 20 خلايا لكل واضح ومباشر 8. لم يتم مدبب حجم أكبر microwell بالكامل، لذلك يحاول تشكيل الأجسام الشبه الكروية من أعداد صغيرة من الخلايا قد يؤدي إلى أصغر الأجسام الشبه الكروية متعددة في كل microwell. بسبب اختلافات طفيفة في خصائص السطح، وإعداد مع الحل السطحي (الخطوة 1.2) ليست اختيارية عند استخدام لوحات AggreWell 400Ex. ويستند هذا البروتوكول على استخدام AggreWell 400 لوحات – لغيرها من الأشكال سلبياتULT الجدول 1. يتم تحديد عدد الخلايا ليتم تحميلها في كل بئر عن طريق ضرب عدد من microwells أنه يحتوي على عدد من الخلايا لتكون متفاوت لكل كروي. على سبيل المثال، لتوليد الأجسام الشبه الكروية من 1000 خلية لكل منهما، يجب أن يتم تحميل كل بئر مع (1،200 مرات الكروية 1،000 خلايا لكل =) 1.2 × 10 6 خلايا. يجب أن تحسب كثافة الخلية نظرا إلى أن الخلايا سيتم تحميلها في حجم 0.4 مل. وذلك لمثال الكروية شكلت من 1000 خلية لكل منهما، 1.2 × 10 6 خلايا في 0.4 مل يترجم إلى كثافة 3 × 10 6 خلايا لكل مل. 1. تستعد لاستقبال خلايا Microwells لوحات Microwell هي عقيمة على النحو المنصوص عليه، ويجب إزالة فقط من عبواتها في بيئة معقمة مثل الوزراء للسلامة الأحيائية الصفحي تدفق. ينبغي الحفاظ على العقم في جميع أنحاء البروتوكول. يجب أن يتعرض للخطر العقم، وresterilized الآبار باستخدام الايثانول 70٪ في استخدام المياهالخطوات التالية اختيارية. إضافة 0.5 مل من الايثانول 70٪ إلى كل بئر غير المستخدمة. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. بينما بخار الإيثانول يجب تتخلل بسرعة أي فقاعات، وإذا كانت هناك أعداد كبيرة قد يكون من المرغوب فيه لإزالتها. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 ز س. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. احتضان لمدة 5 دقائق مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة. نضح الإيثانول. ويمكن الآن أن تغسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني للاستخدام الفوري، أو تجفف الهواء للتخزين. من أجل ضمان أن الخلايا لا تتفاعل مع سطح microwell، قد يكون مستعدا باستخدام بالسطح. بشكل عام هومن المستحسن أن تنفيذ هذه الخطوة في البداية، وبعد ذلك مقارنة الكروية ولدت مع وبدون microwells المغلفة بالسطح. إضافة 0.5 مل من محلول الشطف إلى كل بئر. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. احتضان لمدة ثلاثين دقيقة على الأقل مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين لوحات في أربع درجات مع الحل السطحي في الآبار لحين الحاجة إليها إذا محكمة الغلق لمنع الجفاف. غسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني على الفور قبل استخدامها. لا تسمح لوحاتلتجف بعد الطلاء. 2. إعداد خلايا ملاحظة: إن تفاصيل إعداد الخلايا تختلف إلى حد ما مع نوع من الخلايا المحددة التي تجري دراستها. ومع ذلك لاحظنا هذه الشروط أن تكون فعالة مع طائفة واسعة من الخلايا، بما في ذلك خطوط مناقشتها هنا، وكذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفئران (ESC)، والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (التوجيهية)، الخلايا الليفية، الأديم البدائية المفترضة، والخلايا اللحمية. استخدمت مجموعات أخرى هذا النظام بنجاح لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك تكون الغضروف من الخلايا الجذعية الوسيطة 9، الجيل موحدة السلائف العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة 10، تحليلات السمية في خلايا الكبد 11 وتقييم تجديد النخاع الشوكي في السلمندر 12. يظهر بروتوكول معين للعمل مع خلايا HT29 هنا. تبدأ مع قارورة T75 الخلايا HT29، المثقف في DMEM+ 10٪ FBS نضح المتوسطة النمو من القارورة، وإضافة 3 مل من التربسين. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. وقف التربسين الهضم بإضافة 3 مل من النمو المتوسط. اتخاذ قسامة لعد الخلايا ونقل ما تبقى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. في حين أن الطرد المركزي في التقدم، عد الخلايا. نضح التربسين / خليط المتوسطة واستبدالها مع متوسط ​​نمو جديدة، وحجم تحددها كثافة الخلية المطلوبة والمحسوبة أعلاه. (اختياري) تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة من أجل إزالة أي كتل. ملاحظة: ظروف الحصاد خلية سوف تختلف نوعا ما بين السطور. إذا كان البروتوكول تفارق لمثل الركض الخلايا من الفائدة المتاحة، التي ينبغي أن تستخدم كنقطة انطلاق. مع استخدام خطوط الخلايا الحساسة من التربسين قد يؤدي إلى موت الخلايا المفرطة. في هذه الحالات لاحظنا نتائج جيدة باستخدام TrypLE باعتبارها dissociati البديلةعلى كاشف 8. إذا كانت الخلايا تصبح تجمعت خلال التفكك وتفقد قدرتها على البقاء، إضافة إلى الدناز الحل الانزيم قد حل هذه. يمكن خفض أوقات التفكك وتوظيف خطوة سحن لتفريق كتل الخلايا أيضا زيادة قدرتها على البقاء. 3. تشكيل كروي ملاحظة: قد يتم إنشاء الأجسام الشبه الكروية في مجموعة متنوعة من الصيغ المتوسطة، ينبغي إجراء محاكمات ولكن الأولي خارج باستخدام المتوسطة التي كانت الخلايا المستزرعة، للتمييز عواقب التحول إلى نظام الثقافة 3 الابعاد من عواقب تغيير التركيبة المتوسطة. إضافة 0.4 مل من النمو المتوسط ​​إلى كل بئر. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة قبل الطرد المركزي. قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. إضافة 0.4 ملتعليق خلية في الكثافة المطلوبة (يحسب أعلاه). المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا، دون إدخال فقاعات الهواء إلى microwells. فمن المهم للتأكد من أن الخلايا توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر، من أجل الحصول على الأجسام الشبه الكروية متسقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. إذا ما كانت لوحة يست على مستوى الذات أثناء الطرد المركزي، قد تنشأ تيارات الحمل الحراري التي تؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للخلايا عبر microwells. لذلك، ينبغي أن تكون متوازنة لوحة داخليا وكذلك ضد لوحة أخرى، بحيث يتم توزيع الوزن بالتساوي على كلا الجانبين من لوحة الناقل. ملاحظة: إذا كان يعتبر دليلا على التوزيع غير المتكافئ الخلية، قد يكون من الضروري تطبيق كمية صغيرة من تزييت إلى النقاط المحورية على الناقل لوحة – التشاور مع الشركة المصنعة للأجهزة الطرد المركزي للحصول على تعليمات. ملاحظة: مرة واحدة وقد تم طرد الخلايا في microwells، فهي المقاومات معقولتانت لغسل الخروج من الاقتراحات بسيطة من لوحة. وينبغي تجنب الحركات المفاجئة التي تؤدي إلى الخوض في المتوسط، ولكن نقل لوحة من أجهزة الطرد المركزي إلى المجهر أو الحاضنة لا ينبغي أن يؤدي إلى تشريد خلية كبيرة. باستخدام مجهر مقلوب، تحقق من أن الخلايا قد تتجمع داخل microwells، وأنها توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. باستخدام مجهر مقلوب، ومراقبة عملية تشكيل كروي. وبعض خطوط الخلايا تشكيل الأجسام الشبه الكروية التعاقد في غضون 24 ساعة، والبعض الآخر قد يستغرق وقتا أطول. يظهر تطور من مجموعة لتجميع الخلايا في HT29 في الشكل 2. استعادة الكروية من microwells ونقل إلى الثقافة والتعليق من النفث بها بلطف مع ماصة. بدلا من ذلك، الحفاظ على الأجسام الشبه الكروية في الموقع مع استبدال المتوسطة 8 – ومدة يعتمد على حجمها الأولي ومعدل النمو، الذي مواطنهالمعهد الوطني للإحصاء الوقت حتى تتفوق على microwells التي تم تشكيلها. ليحل محل المتوسطة دون أن تفقد الكروية والمتوسطة نضح على حافة البئر باستخدام ماصة باستور. جلب ببطء غيض أسفل حتى يبدأ في رسم السائل من الغضروف المفصلي، واتبع الغضروف المفصلي على النحو ينخفض. ثم تضاف متوسطة جديدة ضد الجدار جيدا في نفس المكان. قد يتم فقدان بضعة الكروية، ولكن إذا ويستنشق المتوسطة دائما واستبدالها في نفس الموقف، وهذا العدد لا تزال صغيرة بالمقارنة مع أعداد كبيرة في البئر.