La production de grands nombres de tumeurs Sphéroïdes Taille contrôlée à l'aide de micro puits Plaques

REMARQUE: plaques de microtitration sont disponibles dans différents formats, selon les résultats souhaités. Spécifications ainsi que des directives approximatives pour les nombres minimum et maximum de cellules qui doivent être utilisés avec chaque format sont présentés dans le tableau 1. Les petites cupules s'effilent en pointe, et donc il n'y a pas de limite de taille inférieure, bien que la variabilité entre les sphéroïdes devient plus important dans les petites tailles. Production de routine de sphéroïdes d'une moyenne d'aussi peu que 20 cellules chacune est simple 8. La plus grande taille de micropuits n'est pas entièrement conique, tente donc de former des sphéroïdes de petits nombres de cellules peut se traduire par de multiples petits sphéroïdes dans chaque micropuits. En raison de légères différences dans les propriétés de surface, la préparation de la solution de tensioactif (étape 1.2) n'est pas une option en utilisant les plateaux AggreWell 400EX. Ce protocole est basé sur l'utilisation de plaques AggreWell 400 – pour les autres formats inconvénientsult Tableau 1. Le nombre de cellules devant être chargés dans chaque puits est déterminée en multipliant le nombre de micropuits qu'il contient par le nombre de cellules à cluster pour chaque sphéroïde. Par exemple, pour produire des sphéroïdes à partir de 1 000 cellules chacun, chaque puits doit être chargé avec des sphéroïdes (1200 fois 1000 cellules chacune) = 1,2 x 10 6 cellules. La densité cellulaire doit être calculée, étant donné que les cellules sont chargées dans un volume de 0,4 ml. Ainsi, pour l'exemple de sphéroïdes formés à partir de 1.000 cellules chacun, 1,2 x 10 6 cellules dans 0,4 ml se traduit par une densité de 3 x 10 6 cellules par ml. Une. Micropuits se préparent à recevoir des cellules microplaques sont stériles comme prévu, et ne doivent être retirés de leur emballage dans un environnement stérile, comme une enceinte de biosécurité laminaire d'écoulement. La stérilité doit être maintenue tout au long du protocole. La stérilité doit être compromise, les puits sont restérilisés en utilisant 70% d'éthanol dans de l'eau en utilisant l'étapes facultatives suivantes. Ajouter 0,5 ml d'éthanol à 70% à chaque puits utilisé. Certains micropuits volonté des bulles d'air de piégeage, bien que cela puisse être réduite en ajoutant un liquide d'un côté, et en lui permettant de se répandre à travers la surface, plutôt que de la laisser tomber verticalement sur la surface. Replacer le couvercle. Bien que la vapeur d'éthanol devrait rapidement imprégner les bulles, si il ya un grand nombre, il peut être souhaitable de les supprimer. Centrifuger 2 min à 2000 x g. On notera qu'il est important de s'assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse. L'utilisation d'un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule. Incuber pendant 5 min avec le couvercle à la température ambiante. Aspirer l'éthanol. Plaque peut maintenant être lavé avec de l'eau stérile ou PBS pour une utilisation immédiate, ou séché à l'air pour le stockage. Afin d'assurer que les cellules n'interagissent pas avec la surface de micropuits, il peut être préparé en utilisant un agent tensio-actif. En général, il estconseillé d'effectuer cette étape un premier temps, et ensuite comparer sphéroïdes générés avec et sans tensioactifs micropuits revêtus. Ajouter 0,5 ml de solution de rinçage à chaque puits. Certains micropuits volonté des bulles d'air de piégeage, bien que cela puisse être réduite en ajoutant un liquide d'un côté, et en lui permettant de se répandre à travers la surface, plutôt que de la laisser tomber verticalement sur la surface. Replacer le couvercle. Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer les bulles. On notera qu'il est important de s'assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse. L'utilisation d'un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule. Incuber pendant au moins 30 minutes avec le couvercle à la température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Les plaques peuvent être conservées à quatre degrés avec la solution de tensioactif dans le puits jusqu'à ce que nécessaire si elle est correctement fermé pour éviter le dessèchement. Laver les plaques avec du PBS ou de l'eau stérile immédiatement avant utilisation. Ne pas laisser les plaquesà sécher après le revêtement. 2. Préparation de cellules NOTE: Les détails de la préparation de cellules peuvent varier quelque peu avec le type de cellule spécifique à l'étude. Cependant, nous avons observé ces conditions pour être efficace avec une large gamme de cellules, y compris les lignes discutées ici, ainsi que des cellules souches embryonnaires humaines et murines (ESC), les cellules souches pluripotentes humaines induites (iPSC), des fibroblastes, endoderme primitif putatif, et les cellules stromales. D'autres groupes ont utilisé ce système avec succès pour une large gamme d'applications, y compris la chondrogenèse de cellules souches mésenchymateuses 9, la production standardisée des précurseurs neuraux à partir de cellules souches pluripotentes 10, analyses toxicologiques dans les hépatocytes 11 et l'évaluation de régénération de la moelle épinière à la salamandre 12. Le protocole spécifique pour travailler avec les cellules HT29 est montré ici. Commencer avec un flacon T75 de cellules HT29, cultivées dans du DMEM+ 10% de FBS milieu de croissance de Aspirer à partir de flacon, et ajouter 3 ml de trypsine. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de croissance. Prélever une partie aliquote pour le comptage des cellules et transférer le reste dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g. Alors que la centrifugation est en cours, compter les cellules. Aspirer la trypsine / mélange de milieu et de le remplacer par du milieu de croissance frais, du volume déterminé par la densité de cellules telle que calculée ci-dessus. (OPTION) Passez la suspension de cellules à travers une passoire pour éliminer toutes les grumeaux. NOTE: Les conditions de récolte cellulaire varient quelque peu entre les lignes. Si un protocole de dissociation, par exemple pour repiquer les cellules d'intérêt sont disponibles, qui doit être utilisé en tant que point de départ. Avec les lignées cellulaires sensibles à l'utilisation de la trypsine peut entraîner une mort cellulaire excessive. Dans ces cas, nous avons observé de bons résultats en utilisant TrypLE comme une solution de rechange dissociatile réactif 8. Si les cellules deviennent agglomérée au cours de la dissociation et perdent leur viabilité, l'addition de DNase à la solution d'enzyme peut résoudre ce problème. La réduction des temps de dissociation et utilisant une étape de trituration de briser les mottes de cellules peut également accroître la viabilité. 3. Formation sphéroïde REMARQUE: Les sphéroïdes peuvent être produits dans une variété de formulations de milieu, les essais cependant initiales doivent être effectuées en utilisant le milieu dans lequel les cellules sont mises en culture, de distinguer les conséquences de la transition vers un système de culture en 3 dimensions à partir des conséquences de l'évolution composition de milieu. Ajouter 0,4 ml de milieu de culture dans chaque puits. Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer les bulles. On notera qu'il est important de s'assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse avant la centrifugation. L'utilisation d'un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule. Ajouter 0,4 mlsuspension de cellules à la densité requise (calculée ci-dessus). Mélanger doucement par pipetage de haut en bas, sans introduire de bulles d'air dans les puits. Il est important de veiller à ce que les cellules sont réparties uniformément dans le puits, afin d'obtenir des sphéroïdes conformes. Centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g. Si la plaque n'est pas auto-niveau pendant la centrifugation, les courants de convection qui peuvent survenir suite à la distribution inégale des cellules dans les puits. Par conséquent, la plaque doit être équilibrée en interne, ainsi que contre l'autre plaque, de sorte que le poids est réparti uniformément sur les deux faces du support de plaque. NOTE: Si la preuve de la distribution inégale des cellules est vu, il peut être nécessaire d'appliquer une petite quantité de lubrifiant pour les points de pivot sur le support de plaque – consulter le fabricant de centrifugeuse pour obtenir des instructions. NOTE: Une fois que les cellules ont été centrifugés dans les puits, ils sont raisonnablement résistanceTant de lavage de mouvements mineurs de la plaque. Mouvements brusques qui se traduisent par le ballottement du milieu doivent être évités, mais le transfert de la plaque de la centrifugeuse de microscope ou incubateur ne devraient pas entraîner le déplacement cellulaire significative. En utilisant un microscope inversé, de vérifier que les cellules sont groupées dans les micropuits, et qu'elles sont réparties de façon uniforme à travers le puits. Incuber pendant une nuit à 37 ° C. En utilisant un microscope inversé, d'observer le processus de formation sphéroïde. Certaines lignées de cellules formeront sphéroïdes compacts dans les 24 heures, d'autres peuvent prendre plus de temps. La progression de la grappe à s'agréger dans des cellules HT29 est représenté sur la figure 2. Récupérer à partir de sphéroïdes les micropuits et les transférer à une culture en suspension en les projeter doucement avec une pipette. Sinon, maintenir sphéroïdes in situ avec remplacement du milieu 8 – la durée dépend de leur taille initiale et le taux de croissance, qui define le temps jusqu'à ce qu'ils grandissent les puits dans lesquels ils ont été formés. Pour remplacer le milieu sans perdre sphéroïdes, moyen d'aspiration au niveau du bord du puits à l'aide d'une pipette de Pasteur. Ramenez lentement la pointe vers le bas jusqu'à ce qu'il commence à aspirer le liquide du ménisque, et suivre le ménisque glisser vers le bas. Puis ajouter du milieu frais contre la paroi du puits à la même place. Quelques sphéroïdes peuvent être perdus, mais si le milieu est toujours aspiré et remplacé dans la même position, ce nombre restera faible en comparaison avec les grands nombres dans le puits.