Los métodos para realizar cruces en<em> Setaria viridis</em>, Un nuevo sistema de modelo para las gramíneas
Summary
Hemos desarrollado una metodología para la realización de cruces en Setaria viridis (S. viridis). El método consiste en la poda de la panícula antes de un tratamiento de agua caliente para matar el polen viable. Cruces se realizan siguiendo un régimen de crecimiento bien controlada y típicamente dan lugar a la recuperación de 1 a 7 cruz de polinización semillas / s por panícula.
Abstract
Setaria viridis es un sistema modelo emergente para C 4 pastos. Está estrechamente relacionado con la alimentación de la bioenergía de stock pasto varilla y la cola de zorra mijo la cosecha de grano. Recientemente, el genoma de 510 Mb de mijo de cola de zorra, S. italica, ha sido secuenciado 1,2 y una secuencia del genoma 25x cobertura de la maleza relativa S. viridis está en curso. S. viridis tiene una serie de características que lo convierten en un sistema genético modelo potencialmente excelentes incluyendo un tiempo de generación rápida, baja estatura, las necesidades de crecimiento simples, la producción de semilla prolífica 3 y sistemas desarrollados para ambos transitoria y estable de transformación 4. Sin embargo, la genética de S. viridis es en gran parte sin explorar, en parte, debido a la falta de métodos detallados para la realización de cruces. Hasta la fecha, no existe un protocolo estándar ha sido adoptado, que permita una rápida producción de semillas a partir de cruzamientos controlados.
La presión de protocoloented aquí está optimizada para realizar cruces genéticos en S. viridis, A10.1 adhesión. Hemos empleado un simple tratamiento térmico con agua caliente para la castración después de la poda de la panoja para retener 20-30 floretes y etiquetado de las flores para eliminar las semillas resultantes de flores recién desarrolladas después de la castración. Después de probar una serie de tratamientos térmicos a temperaturas permisivas y variando la duración de la inmersión, hemos establecido una temperatura óptima y el rango de tiempo de 48 ° C durante 3-6 min. Al utilizar este método, un mínimo de 15 cruces puede ser realizada por un solo trabajador por día y un promedio de 3-5 progenie outcross por panícula se puede recuperar. Por lo tanto, un promedio de 45-75 progenie outcross puede ser producido por una persona en un solo día. La amplia aplicación de esta técnica facilitará el desarrollo de poblaciones de líneas endogámicas recombinantes de S. viridis X S. viridis o S. viridis X S. italica, la cartografía de las mutaciones a través de mayor síanálisis gregant y creando mayores mutantes de pedido para el análisis genético.
Introduction
S. viridis es una NADP-ME subtipo C 4 hierba muy relacionado con la alimentación de la bioenergía de stock switchgrass (NAD-ME subtipo), la cola de zorra mijo la cosecha de grano, y la mala hierba pasto guinea agrícola 5. El genoma de 510 Mb de forma cultivada de Setaria, S. italica, ha sido recientemente secuenciado 1,2 y una secuencia del genoma 25x cobertura de la maleza emparentada, S. viridis, está en curso (no publicado). S. viridis tiene una serie de características que lo convierten en un sistema genético modelo potencialmente excelentes incluyendo un tiempo de generación rápida, baja estatura, las necesidades de crecimiento simples, y la producción de semilla prolífica 3. Es importante destacar que, métodos recientemente se han desarrollado tanto para transformación transitoria y estable de S. viridis, que proporcionan la oportunidad para la creación de plantas transgénicas 4. Sin embargo, un importante cuello de botella en el desarrollo de herramientas genéticas para S. viridis es su recálculoItrance de fecundación cruzada. Hasta la fecha, no existe un protocolo estándar se ha publicado que permita una rápida producción de semillas a partir de cruzamientos controlados.
Cruces genéticos en S. italica comúnmente se realizan por la castración mediante la eliminación de las anteras de las flores 6,7,8 o mediante el tratamiento térmico de las flores de los progenitores femeninos 9-11. Después de estos tratamientos, las anteras o panículas de flores no tratadas / progenitores masculinos están desgastados suavemente contra los estigmas que liberan polen. En la emasculación, anteras son removidos usando unas pinzas finas inmediatamente después de abrir el florete y la antera está empezando a exsert, pero aún no ha emitido polen 6-8. Entre los retos de este último método es la dificultad en la realización de la castración en un intervalo de tiempo estrecho entre la apertura y la liberación del polen de la flor. La duración de la apertura y el cierre de una sola flor variará dependiendo de la adhesión y la condición del medio ambiente, y puede variar de 7 min <sup> 6-2,5 horas 12 en S. italica. Desde el desprendimiento de polen se produce como anteras exsert del florete, anteras necesitan ser removidos con cuidado y de forma rápida, y por lo tanto, es difícil evitar la contaminación debido a la auto-polinización. Además, como polinizaciones se realizan inmediatamente después de la castración, el número de cruces que se pueden realizar por persona / por día es limitado.
Como un método alternativo, panículas maduras se pueden sumergir en agua caliente para calentar-matar el desarrollo de los granos de polen 9,10,13,14 con la ventaja de la realización de cruces en un gran número de panículas. Sin embargo, la temperatura y la duración del tratamiento térmico varía ampliamente de diferentes experimentos (por ejemplo, 47 ° C durante 10 min 14 y 42 ° C durante 20 min 10). Por otra parte, no hay análisis sistemáticos sobre la eficacia de emasculaciones mediada por calor se han publicado. Por lo tanto, un método simple y estándar para llevar a cabo cruces genéticos en S. viridis aceleraría enormemente el desarrollo de los recursos genéticos y el establecimiento de S. viridis como un sistema modelo en la comunidad investigadora.
Se presenta el desarrollo y optimización de un protocolo estándar para la realización de los cruces genéticos en S. viridis. Las plantas se cultivan en ambientes controlados para sincronizar desarrollo de la flor y aumentar la reproducibilidad del procedimiento. Cruces se realizan usando un S. transgénico línea viridis como el progenitor masculino que contiene el gen indicador GUS 4 para facilitar la identificación de cruces genéticos controlados exitosas. El transgén GUS está dirigida por un promotor de ubiquitina de arroz que permite el marcador de semillas F1 inmediatamente después de la cosecha y por lo tanto proporciona un ensayo cualitativo fácil para determinar la eficiencia de la emasculación y polinización. Hemos empleado un simple tratamiento térmico con agua caliente para la emasculación acompañado de etiquetado de las flores que han sido emasculated para eliminar las semillas resultantes de flores recién desarrolladas después de la castración. Después de probar una serie de tratamientos térmicos a temperaturas permisivas y variando la duración de la inmersión en agua caliente, hemos establecido un tiempo y temperatura óptimos duraciones de 48 ° C 3-6 min. Se encontró un tratamiento en frío antes del amanecer para promover la floración sincrónica de ambos padres con el fin de facilitar la polinización cruzada. También hemos hablado de los pasos clave en el protocolo y la futura aplicación de este método a otras adhesiones Setaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Importancia del tratamiento antes del amanecer
Para obtener una alta frecuencia de progenie outcross que es fundamental contar con la antesis alta sincronía de progenitores masculinos y femeninos. Inicialmente, nos paseamos regímenes de temperatura y luz (31 ° C/22 ° C, día / noche) y utilizamos el S. viridis A10.1 la adhesión de todos los polinizaciones. En estas condiciones, la mayoría de las flores se abren temprano en la mañana, antes de que la temperatura se eleva a 31 ° C, aunque algunas flores abiertas al azar entre las 8:00 am-8: 00 AM. Estudios previos en S. italica indican que la hora del día, la ubicación y la temporada contribuyen a la variación en la antesis 7,15,16. Siles et al. 6 señaló que la floración se asoció a cambios súbitos de temperatura y humedad, pero no con la baja temperatura y alta humedad, per se, como se ha concluido en estudios previos 7,15. Por lo tanto, hemos empleado una de la madrugada el tratamiento en frío de 15 ° C durante 30 minutos (de 8:30 AM-9: 00 AM) para imitarla condición previa al amanecer natural. Este tratamiento en frío antes del amanecer ayudó en la sincronización de la floración en los padres. Hemos observado que a pesar de la configuración de la cámara para niveles de humedad relativa de 50%, la humedad relativa dentro de la cámara aumentó a un nivel por encima de 70% cuando la temperatura se redujo de 22 ° C a 15 ° C y continuó a mantenerse por encima de 70% hasta que la temperatura subió gradualmente a 31 ° C después de las 9:30 AM. A las 9:00 de la mañana, castrado progenitores femeninos y plantas de progenitor masculino se llevaron al laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21.79% ± 1.15%). Flores de los progenitores masculinos comienzan a abrirse alrededor de 10:10 de la mañana, y la polinización se pueden realizar a las 10:30 AM-11: 00 PM. Una lista detallada de todos los reactivos y el equipo se proporciona en la Tabla 2.
Importancia de la preparación de la panícula de emasculación
Bajo las condiciones de la cámara en este estudio (Figura 1), la duración de la floración panícula primaria varió desde2-3 días. Típicamente, las flores se encuentran en el medio distal de la inflorescencia (Figura 2A) se abren primero y apertura precede proximal y distal. El número ideal de flores para ser retenidas en la panícula es 20-30. Se debe tener precaución durante la extracción de las flores inmaduras de manera que se conservan sólo las flores bien desarrolladas (la flor más alta o más grandes en la espiguilla 17). Etiquetado con marcador rojo en ambos lados de las flores ayuda a distinguir de manera eficiente la progenie de cruce abierto putativo a partir de semillas de flores recién desarrollados después de la emasculación. Además, es importante dejar las cerdas sobre las panículas antes de la castración para proteger los flósculos de extensa daño por calor, sin embargo, como una opción, que se puede quitar después de la emasculación usando tijeras de primavera con el fin de facilitar la polinización, especialmente cuando la unión una panícula técnica se emplea (Figuras 2C y 2D).
Con la temperatura óptimala duración del tratamiento d para el tratamiento de agua tibia
La base para la emasculación a través de inmersión en agua caliente es que el polen es más sensible al calor que la superficie del estigma. Sin embargo, la duración y la temperatura de los tratamientos térmicos pueden variar entre especies y accesiones Setaria. En general, una temperatura más alta con un tiempo de tratamiento más corto o una temperatura más baja con un tiempo de tratamiento más largo tendrá el mismo efecto en la emasculación. Se ha informado de que un tratamiento térmico de 42 ° C durante 20 min 10 o 47 ° C durante 10 min 14 S. prestados italica polen no viable, pero la eficacia de estos tratamientos no se determinó. Hemos desarrollado nuestro protocolo siguiendo la hipótesis de que bajo la temperatura óptima y la duración del tratamiento, el polen de todas las flores retenido en el progenitor femenino será inviable mientras estigmas seguirán siendo receptivos. Sin embargo, después de comparar y analizar los efectos de diferentes temperaturas yperíodos de tratamiento (Tabla 1), se encontró que la sensibilidad al tratamiento térmico varía entre las flores retenidos en cada panícula, por lo que es difícil de eliminar por completo las semillas resultantes de la auto-polinización. Llegamos a la conclusión de que la eficiencia de la producción de progenie polinización cruzada es la mayor cuando los tratamientos se llevaron a cabo a 48 ° C durante 3-6 min en S. viridis A10.1 adhesión.
Tiempo de pico de la floración y la polinización cruzada
Cuando las flores llegan a la madurez, y están a punto de abrir, las anteras son de color blanco amarillento y el polen se desprenden en cuanto anteras exsert de las flores 8. Anteras convierten gradualmente marrón después de polen se desprende como las flores comienzan a cerrarse. Una vez liberado, la viabilidad del polen es desconocido. Por lo tanto, es muy importante utilizar el polen de apertura o flores recién abiertas en el progenitor masculino, tan pronto como sea posible. Bajo nuestras condiciones de la cámara (Figura 1), la mayoría de las flors de los progenitores masculinos empiezan a abrir a las 10:10 AM y las flores abiertas arrojan polen a las 10:30 AM. Así, la ventana conveniente para realizar la polinización es entre las 10:30 AM y las 11:00 AM. Los estigmas se mantienen fuera de las glumas después de flores cerca y pueden ser receptivos al polen. Esto se ha observado previamente y confirmado en S. italica que los estigmas son receptivos durante aproximadamente 48 horas después de la apertura de la flor por Siles et al. 6, por lo que es importante para panículas bolsa tras el tratamiento térmico y después de la realización de cruzamientos controlados. Como se discutió anteriormente, se recomienda polinizaciones rendimiento tanto en el día 2 y el día 3 después de la castración.
Métodos para la polinización
Se comparó la eficacia de tres técnicas de polinización. Si no son limitantes flores floreciendo, la polinización-panoja a panícula es la técnica más eficiente y producirá un mayor número de progenie outcross. Si panículas florecen son limitantes, una mayor frecuencia de outcross progenie se produce cuando se utiliza el método de antera-al estigma. Hemos obtenido descendencia outcross de ambos métodos con éxito. El método "panículas de unión" se ha utilizado en el cruce S. italica 6, pero nos pareció que este método es el método menos eficaz que la ventana de tiempo para el derramamiento de polen del progenitor masculino es corto. Por otra parte, hay menos control sobre la polinización y las cerdas sobre S. panículas viridis también pueden obstaculizar el movimiento del polen en la superficie del estigma.
Cosecha de semillas, secado y almacenamiento
Después de la cosecha, las semillas deben secarse a 30-33 ° C durante 2 días. Antecio deben ser eliminados para la tinción GUS, si es necesario. Las semillas deben ser almacenadas en un lugar fresco y seco (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21.79% ± 1.15%) para el almacenamiento a corto plazo (menos de dos años) o en una cámara de semillas (T: 4.0- 10 ° C ± 1,0 ° C, humedad relativa: 20% ± 1%) para el almacenamiento a largo plazo.Malas condiciones de almacenamiento pueden dar lugar a bajas tasas de viabilidad 8. Hemos observado que la tasa de germinación de S. viridis A10.1 es de aproximadamente 5% cuando se siembra 4 días después de la cosecha, pero se puede aumentar a 90-96% después de almacenamiento en el laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para 110 días posteriores a la cosecha seguida de una estratificación de tres días a -80 ° C para romper la latencia de las semillas. Para la estratificación a -80 ° C, semillas secas se pueden colocar en un recipiente hermético (por ejemplo, tubo de microcentrífuga o sobre moneda en una bolsa de plástico sellada) y se mantuvieron a -80 ° C durante 3 días antes de plantar. Después de 16 meses de almacenamiento en el laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21,79% ± 1,15%), los porcentajes de germinación de 90-95% aún se puede obtener. Además, para romper la latencia, las semillas pueden ser secaron a 30-33 ° C durante 2 días después de la cosecha, y entonces se dan de tres días estratificación a -80 ° C, seguido de la eliminación de losantecio antes de plantar. Después de estos tratamientos, las tasas de germinación de semillas de hasta 33% se puede lograr.
Ventajas, limitaciones y posibles modificaciones
Aquí le ofrecemos el primer protocolo estándar para la realización de cruces en S. viridis A10.1 mediante el uso de un tratamiento de calor para la castración. A diferencia de la castración física, este protocolo es menos invasiva y relativamente fácil de establecer en un laboratorio. Por lo general toma alrededor de 15 minutos para recortar una panícula y unos 15 panículas se puede recortar y cruzó / persona / día. Asumiendo un promedio de 3-5 outcross progenie / panoja se puede recuperar en condiciones óptimas, con un total de 45-75 progenie outcross puede ser producido por una persona en un solo día. Además, esta técnica puede aplicarse a cruces en otras especies de Setaria, aunque optimizaciones adicionales serán probables. Si el espacio de cámara de crecimiento es limitado, las plantas pueden ser cultivadas en invernadero o cámara de crecimiento sin tratados antes del amanecertamento hasta la panícula emerge antes de que sean trasladados a las condiciones de la cámara optimizadas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Sankalpi Warnasooriya y Amy Humboldt para la lectura crítica y la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de Departamento de Energía (DE-SC0008769) y la Fundación Nacional para la Ciencia (IOS-1.127.017).
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
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