Metodi per l'esecuzione di Croci nel<em> Setaria viridis</em>, Un nuovo sistema Modello per le Erbe
Summary
Abbiamo sviluppato una metodologia per l'esecuzione di croci in viridis Setaria viridis (S.). Il metodo prevede la potatura pannocchia prima di un trattamento con acqua calda per uccidere polline vitale. Croci sono eseguite seguendo un regime di crescita ben controllata e in genere portato al recupero di 1-7 impollinazione incrociata seme / s per pannocchia.
Abstract
Setaria viridis è un sistema modello emergente per C 4 erbe. Esso è strettamente legato al feed bioenergia magazzino verga e il raccolto di grano coda di volpe miglio. Recentemente, il genoma 510 Mb di coda di volpe miglio, S. italica, è stato sequenziato 1,2 e una sequenza del genoma 25x copertura del erbacce relativo S. viridis è in corso. S. viridis ha una serie di caratteristiche che lo rendono un sistema genetico modello potenzialmente eccellente tra cui un tempo rapido di generazione, bassa statura, semplici esigenze di crescita, produzione di sementi prolifico 3 e sistemi sviluppati sia transiente e stabile trasformazione 4. Tuttavia, la genetica di S. viridis è ampiamente esplorato, in parte, a causa della mancanza di metodi dettagliati per lo svolgimento croci. Ad oggi, nessun protocollo standard è stato adottato che permetterà una rapida produzione di sementi da incroci controllati.
La pressione del protocolloENTED qui è ottimizzato per l'esecuzione di incroci genetici in S. viridis, A10.1 adesione. Abbiamo impiegato un semplice trattamento termico con acqua calda per emasculation dopo la potatura la pannocchia di mantenere 20-30 cimette e l'etichettatura dei fiori per eliminare i semi derivanti dai fiori di nuova concezione dopo la castrazione. Dopo aver testato una serie di trattamenti termici a temperature permissive e variando la durata di immersione, abbiamo stabilito una temperatura ottimale e l'intervallo di tempo di 48 ° C per 3-6 min. Utilizzando questo metodo, un minimo di 15 croci può essere eseguito da un solo operatore per giorno e una media di 3-5 progenie out-cross per pannocchia può essere recuperato. Pertanto, una media di 45-75 progenie out-cross può essere prodotto da una persona in un solo giorno. Attuazione ampio di questa tecnica faciliterà lo sviluppo delle popolazioni di linea inbred ricombinanti di S. viridis X S. viridis o S. viridis X S. italica, mappare le mutazioni attraverso la massa seanalisi gregant e la creazione di mutanti di ordine superiore per l'analisi genetica.
Introduction
S. viridis è un NADP-ME sottotipo C 4 erba strettamente legato al feed bioenergia magazzino panico verga (NAD-ME sottotipo), il raccolto di grano coda di volpe miglio, e la agricolo erbaccia guinea erba 5. Il genoma 510 Mb di forma coltivata di Setaria, S. italica, è stato recentemente sequenziato 1,2 e una sequenza del genoma 25x copertura del relativo erbacce, S. viridis, è in corso (inedito). S. viridis ha una serie di caratteristiche che lo rendono un sistema genetico modello potenzialmente eccellente tra cui un tempo rapido di generazione, bassa statura, semplici esigenze di crescita e produzione di sementi prolifico 3. È importante sottolineare che i metodi sono stati recentemente sviluppato sia per trasformazione transiente e stabile di S. viridis che prevede la possibilità di creare piante transgeniche 4. Tuttavia, un serio ostacolo allo sviluppo di strumenti genetici per S. viridis è la sua recalcitrance a outcrossing. Ad oggi, nessun protocollo standard è stato pubblicato che permetterà una rapida produzione di sementi da incroci controllati.
Incroci genetici a S. italica sono di solito eseguite da castrazione attraverso la rimozione delle antere dai fiori 6,7,8 o attraverso il trattamento termico di fiori dei genitori femminili 9-11. A seguito di questi trattamenti, antere o pannocchie di fiori non trattati / genitori maschi sono leggermente abrase contro stimmi liberando il polline. In evirazione, antere vengono rimossi con una pinza sottile subito dopo il fiorellino si apre e l'antera sta cominciando a exsert, ma non ha ancora emesso polline 6-8. Tra le sfide di questo secondo metodo è la difficoltà nell'esecuzione emasculation in un intervallo di tempo stretto tra l'apertura e polline capannone del fiore. La durata di apertura e chiusura di un unico fiore varierà a seconda delle condizioni ambientali e di adesione, e può variare da 7 min <sup> 6-2,5 ore 12 in S. italica. Poiché spargimento di polline si presenta come antere exsert dal fiorellino, antere devono essere rimossi con attenzione e in modo rapido, e quindi, è difficile evitare la contaminazione a causa di auto-impollinazione. Inoltre, come impollinazioni vengono eseguite immediatamente dopo castrazione, il numero di incroci che possono essere eseguite per persona / al giorno è limitato.
Come metodo alternativo, pannocchie mature possono essere immersi in acqua calda per riscaldare-uccidere sviluppo grani di polline 9,10,13,14 con il vantaggio di eseguire croci su un gran numero di pannocchie. Tuttavia, la temperatura e la durata del trattamento termico varia ampiamente da diversi esperimenti (ad esempio 47 ° C per 10 min 14 e 42 ° C per 20 min 10). Inoltre, nessuna analisi sistematiche sull'efficacia di emasculations calore mediata sono stati pubblicati. Così, uno standard e metodo semplice per eseguire incroci genetici in S. viridis potrebbe accelerare notevolmente lo sviluppo delle risorse genetiche e la creazione di S. viridis come sistema modello all'interno della comunità di ricerca.
Riportiamo lo sviluppo e l'ottimizzazione di un protocollo standard per l'esecuzione di incroci genetici in S. viridis. Le piante sono coltivate in ambienti controllati per sincronizzare lo sviluppo del fiore e aumentare la riproducibilità della procedura. Croci sono eseguiti utilizzando una S. transgenico linea viridis come il genitore maschio contenente il gene GUS giornalista 4 per facilitare l'identificazione di incroci genetici controllate successo. Il transgene GUS è guidata da un promotore ubiquitina riso che consente il punteggio di semi F1 immediatamente dopo la raccolta e quindi fornisce un saggio qualitativo facile determinare l'efficienza di castrazione e impollinazione. Abbiamo impiegato un semplice trattamento termico con acqua calda per emasculation accompagnati da una etichettatura di fiori che sono stati emasculated per eliminare i semi derivanti dai fiori di nuova concezione dopo la castrazione. Dopo aver testato una serie di trattamenti termici a temperature permissive e variando la durata di immersione in acqua calda, abbiamo stabilito una temperatura e tempo ottimali durata di 48 ° C 3-6 min. Un pre-alba trattamento a freddo è stato trovato per promuovere all'antesi sincrono in entrambi i genitori al fine di facilitare l'impollinazione incrociata. Abbiamo anche discusso i passaggi chiave del protocollo e la futura applicazione di questo metodo ad altre adesioni Setaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Importanza del trattamento pre-dawn
Per ottenere una elevata frequenza di progenie out-cross è essenziale avere antesi altamente sincrona dei genitori maschili e femminili. Inizialmente, abbiamo pedalato regimi di temperatura e di luce (31 ° C/22 ° C, giorno / notte) e usato il S. viridis A10.1 adesione per tutte le impollinazioni. In queste condizioni, la maggior parte dei fiori si aprono al mattino presto prima che la temperatura sale a 31 ° C, anche se alcuni fiori aperti in modo casuale tra 08:00-8: 12:00. Precedenti studi a S. italica indicano che ora del giorno, il luogo e la stagione contribuiscono alla variazione antesi 7,15,16. Siles et al. 6 osservato che antesi è stato associato con rapidi cambiamenti di temperatura e umidità, ma non a bassa temperatura e alta umidità, di per sé, come concluso in studi precedenti 7,15. Pertanto, abbiamo impiegato un pre-alba trattamento a freddo di 15 ° C per 30 minuti (dalle 8:30 AM-9: 12:00) per imitarela naturale condizione di pre-alba. Questo trattamento a freddo prima dell'alba aiutato nella sincronizzazione antesi nei genitori. Abbiamo osservato che, nonostante l'impostazione della camera di livelli di umidità relativa del 50%, l'umidità relativa all'interno della camera è aumentata a un livello superiore al 70% quando la temperatura è scesa da 22 ° C a 15 ° C e ha continuato a rimanere al di sopra del 70% fino a che la temperatura gradualmente aumentata a 31 ° C dopo 09:30. Alle 09:00, evirato genitori femminili e piante di genitore maschio vengono portati al laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%). I fiori dei genitori maschi cominciano ad aprirsi intorno 10:10, e l'impollinazione possono essere eseguite a 10:30 AM-11: 12:00. Un elenco dettagliato di tutti i reagenti e attrezzature sono fornite nella tabella 2.
Importanza della preparazione pannocchia di evirazione
Nelle condizioni della camera in questo studio (Figura 1), la durata di primaria fioritura pannocchia variava da2-3 giorni. Tipicamente, fiori situata a metà distale della infiorescenza (Figura 2A) aperta prima e precede apertura prossimale e distale. Il numero ideale di fiori da conservare sulla pannocchia è 20-30. Si deve usare cautela durante la rimozione dei fiori immaturi in modo che solo fiori ben sviluppati (il fiore più in alto o più grandi sulla spighetta 17) vengono mantenuti. Etichettatura con un pennarello rosso su entrambi i lati dei fiori aiuta a distinguere in modo efficiente putativo progenie out-cross da semi di fiori di recente sviluppato dopo la castrazione. Inoltre, è importante lasciare le setole sulle pannocchie prima di evirazione per proteggere le cimette di ingenti danni al calore, tuttavia, come opzione, possono essere rimossi dopo l'evirazione con le forbici a molla per facilitare l'impollinazione, soprattutto quando si associa una pannocchia tecnica viene impiegata (Figure 2C e 2D).
Ottimizzato una temperaturadurata d trattamento per il trattamento dell'acqua calda
La base per emasculation mediante immersione acqua calda è che il polline è più sensibile al calore rispetto alla superficie dello stimma. Tuttavia, la durata e la temperatura dei trattamenti termici possono variare tra le specie e adesioni Setaria. In generale, una temperatura più alta con un tempo di trattamento più breve o una temperatura inferiore con un tempo di trattamento più lungo avrà lo stesso effetto sulla castrazione. E 'stato riportato che un trattamento termico di 42 ° C per 20 min 10 o 47 ° C per 10 min 14 resi S. italica polline non vitale, ma l'efficacia di questi trattamenti non è stata determinata. Abbiamo sviluppato il nostro protocollo segue l'ipotesi che sotto una temperatura ottimale e la durata del trattamento, polline di tutti i fiori trattenuto sul genitore femmina sarà non vitali, mentre stimmi rimarranno ricettivo. Tuttavia, dopo aver confrontato e analizzando gli effetti delle diverse temperature eperiodi di trattamento (Tabella 1), abbiamo scoperto che la sensibilità al trattamento termico varia tra i fiori trattenute su ogni pannocchia, quindi è difficile da eliminare completamente i semi derivanti da auto-impollinazione. Concludiamo che l'efficienza della produzione di progenie out-cross è il massimo quando i trattamenti vengono effettuati a 48 ° C per 3-6 min in S. viridis A10.1 adesione.
Tempo di picco di antesi e impollinazione incrociata
Quando i fiori raggiungono la maturità e sono in procinto di aprire, antere sono di colore bianco di colore giallastro e polline viene versato non appena antere exsert dai fiori 8. Antere gradualmente diventano marroni dopo che il polline è sparso come i fiori cominciano a chiudere. Una volta rilasciato, la vitalità del polline è sconosciuta. Pertanto, è fondamentale utilizzare il polline di apertura o fiori appena aperti sul genitore maschile appena possibile. Nelle nostre condizioni camera (Figura 1), la maggioranza di flowers dei genitori maschi cominciano ad aprirsi alle 10:10 ed i fiori aperti capannone polline alle 10:30. Così, la finestra auspicabile per l'esecuzione di impollinazione è 10:30-11:00. Gli stimmi rimangono al di fuori delle glume dopo fiori stretti e possono essere ricettivi al polline. Questo è stato precedentemente osservato e confermato in S. italica che gli stimmi sono ricettivi per circa 48 ore post-fiore di apertura da Siles et al. 6, quindi è importante pannocchie borsa dopo il trattamento termico e dopo l'esecuzione incroci controllati. Come discusso sopra, si consiglia di impollinazioni performanti sia il Day 2 e Day 3 post-evirazione.
Metodi per l'impollinazione
Abbiamo confrontato l'efficacia di tre tecniche di impollinazione. Se fiorite fiori non sono limitativi, impollinazione pannocchia a pannocchia è la tecnica più efficace e produrrà un maggior numero di progenie out-cross. Se pannocchie fioritura sono limitanti, una maggiore frequenza di outcross progenie sarà prodotto quando viene utilizzato il metodo antera-to-stimma. Abbiamo ottenuto progenie out-cross da entrambi i metodi con successo. Il metodo "pannocchie vincolante" è stato usato in attraversamento S. italica 6 ma abbiamo trovato che questo metodo sia il metodo meno efficace come la finestra temporale di polline spargimento del genitore maschio è breve. Inoltre, c'è meno controllo sulla impollinazione e le setole su S. pannocchie viridis possono anche ostacolare il movimento del polline sulla superficie dello stigma.
Raccolta dei semi, essiccazione e stoccaggio
Dopo la raccolta, semi vanno essiccati a 30-33 ° C per 2 giorni. Anthecium deve essere rimosso per la colorazione GUS, se necessario. I semi devono essere conservati in un luogo fresco e asciutto (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%) per la conservazione a breve termine (meno di due anni) o in una camera di seme (T: 4.0 10 ° C ± 1,0 ° C, umidità relativa: 20% ± 1%) per la conservazione a lungo termine.Cattive condizioni di conservazione possono causare bassi tassi di redditività 8. Abbiamo osservato che il tasso di germinazione di S. viridis A10.1 è di circa il 5% quando seminato quattro giorni dopo la raccolta, ma può essere aumentata al 90-96% dopo lo stoccaggio in laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%) per 110 giorni post-raccolta seguita da una tre giorni di stratificazione a -80 ° C per rompere dormienza dei semi. Per la stratificazione a -80 ° C, semi secchi possono essere inseriti in un contenitore ermetico (ad esempio tubo micro-centrifuga o una busta moneta in un sacchetto di plastica sigillato) e conservati a -80 ° C per 3 giorni prima della semina. Dopo 16 mesi di conservazione in laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%), le percentuali di germinazione del 90-95% possono ancora essere ottenuti. Inoltre, per rompere la dormienza, semi possono essere asciugati a 30-33 ° C per 2 giorni dopo la raccolta, e poi dato tre giorni stratificazione a -80 ° C, seguita dalla rimozione dianthecium prima di piantare. Dopo questi trattamenti, sementi tassi di germinazione fino al 33% può essere raggiunto.
Vantaggi, limiti e le possibili modifiche
Qui forniamo il primo protocollo standard per l'esecuzione di croci in S. viridis A10.1 mediante un trattamento termico per l'evirazione. In contrasto castrazione fisica, questo protocollo è meno invasiva e relativamente facile stabilire in un laboratorio. Di solito ci vogliono circa 15 minuti per tagliare una pannocchia e circa 15 pannocchie può essere tagliata e attraversò / persona / giorno. Ipotizzando una media di 3-5 out-cross discendenti / pannocchia può essere recuperato in condizioni ottimali, per un totale di 45-75 progenie out-cross può essere prodotto da una persona in un solo giorno. Inoltre, questa tecnica può essere applicata a croci in altre specie Setaria, se ottimizzazioni supplementari saranno probabilmente. Se lo spazio camera di crescita è limitato, le piante possono essere coltivate in serra o camere di crescita senza trea prima dell'albaTIMENTO fino a quando la pannocchia emerge prima di essere spostati le condizioni della camera ottimizzate.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sankalpi Warnasooriya e Amy Humboldt per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Department of Energy (DE-SC0008769) e la National Science Foundation (IOS-1.127.017).
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
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