Методы Выполнение Кресты в<em> Setaria виридис</em>, Система Новая модель для трав
Summary
Мы разработали методику выполнения кресты в Setaria Viridis (С. Viridis). Способ включает обрезки метелки до лечения горячей воды, чтобы убить жизнеспособную пыльцу. Кресты выполняются следующие хорошо контролируемого режима роста и обычно приводит к восстановлению от 1 до 7 перекрестное опыление семян / с на метелки.
Abstract
Setaria виридис является новой модельной системой для C 4 трав. Она тесно связана с биоэнергетики сырья просо и зерновых культур щетинника проса. В последнее время 510 Мб геном щетинника просо, S. Италийский, была последовательность 1,2 и 25x охват генома последовательность сорной относительной S. виридис продолжается. С. виридис имеет ряд характеристик, которые делают его потенциально отличная модель генетическая система, включая время быстрое поколения, небольшого роста, простых требований роста, плодовитый производства семян 3 и развитых систем и переходных и стабильной трансформации 4. Тем не менее, генетика S. виридис в значительной степени неисследованными, в частности, в связи с отсутствием детальных методов для выполнения кресты. На сегодняшний день ни стандартный протокол не был принят, что позволит быстрое производство семян из контролируемых крестов.
В прес протоколатированной здесь оптимизирована для выполнения генетических кресты в S. виридис, присоединение А10.1. Мы использовали простой термической обработки с теплой водой для кастрации после обрезки в метелку, чтобы сохранить 20-30 цветочки и маркировки цветов для устранения семена в результате недавно разработанных цветов после кастрации. После тестирования серию термообработки в разрешительных температурах и изменения длительности погружения, мы создали оптимальную температуру и временной диапазон 48 ° С в течение 3-6 мин. При использовании этого метода, как минимум, 15 крестов могут быть выполнены с помощью одного работника в день и в среднем 3-5 скрещивания потомства на метелки могут быть восстановлены. Таким образом, в среднем 45-75 скрещивания потомство может быть получено путем одного человека в течение одного дня. Широкое применение этого метода будет способствовать развитию рекомбинантных инбредных популяций линии из S. виридис X С. виридис или S. виридис X С. Италийский, отображение мутации через навалом себеgregant анализ и создание более высокие мутантов порядка для генетического анализа.
Introduction
С. виридис является НАДФ-МЭ подтип С 4 трава тесно связана с биоэнергетики сырья просо (НАД-ME подтипа), зернового поля щетинника просо, и сельскохозяйственного сорняками морской травы 5. 510 Мб геном культивируемых виде Setaria, S. Италийский, недавно был последовательность 1,2 и 25x охват генома последовательность сорной родственника, S. виридис, находится в процессе (не опубликовано). С. виридис имеет ряд характеристик, которые делают его потенциально отличная модель генетическая система, включая время быстрое поколения, небольшого роста, простых требований роста и плодовитый производства семян 3. Важно отметить, что методы последнее время были разработаны и для переходных и стабильной трансформации S. виридис которые дают возможность для создания трансгенных растений 4. Однако главным препятствием в развитии генетических инструментов для S. виридис является его пересчетitrance чтобы ауткроссинг. На сегодняшний день ни стандартный протокол не было опубликовано, что позволит быстрое производство семян из контролируемых крестов.
Генетические кресты в S. Италийский обычно выполняются кастрации за счет удаления пыльников из цветов 6,7,8 или через термообработки цветов женских родителей 9-11. После этих обработок, пыльников или метелки из необработанных цветов / мужчины родители мягко истирается против рылец выпуская пыльцу. В кастрации, пыльники удаляются с помощью тонких щипцов сразу после цветочек открывается и пыльников начинает exsert, но до сих пор не пролить пыльцу 6-8. Среди проблем этого последнего метода является сложность в выполнении выхолащивание в узком интервале времени между открытием и пыльцы сарай цветка. Продолжительность открытия и закрытия одного цветка будет варьироваться в зависимости от присоединения и состояния окружающей среды, и может составлять от 7 мин <SUP> 6 до 2,5 ч 12 в S. Италийский. С пролития пыльцы происходит пыльники exsert от цветочек, пыльники нужно осторожно удалить и быстро, и поэтому, трудно, чтобы избежать загрязнения из-за самоопыления. Кроме того, как опыление осуществляется непосредственно после кастрации, количество крестов, которые могут выполняться на человека / в день ограничено.
В качестве альтернативного способа, зрелые метелки может быть, смоченной в теплой воде, чтобы нагреть убить развития пыльцевых зерен 9,10,13,14 с преимуществом выполнения кресты на большом количестве метелки. Однако температура и продолжительность термической обработки варьируется от различных экспериментах (например, 47 ° С в течение 10 мин 14 и 42 ° С в течение 20 мин 10). Кроме того, никаких систематических анализов об эффективности тепловых опосредованного emasculations не были опубликованы. Таким образом, стандартный и простой способ выполнения генетических кресты в S. объемрадужки бы значительно ускорить развитие генетических ресурсов и создание S. виридис в качестве модельной системы в рамках научно-исследовательского сообщества.
Мы сообщаем о разработке и оптимизации стандартного протокола для выполнения генетических кресты в S. виридис. Растения выращиваются в контролируемых условиях для синхронизации развития цветок и увеличить воспроизводимость процедуры. Кресты выполняются с использованием трансгенного S. виридис линия как отцовского, содержащего ген GUS репортер 4 для облегчения идентификации успешных контролируемых генетических кресты. GUS трансген приводится в действие риса Убиквитин промоутера, который позволяет счет семян F1 сразу после сбора урожая и, следовательно, обеспечивает легкий качественный анализ, чтобы определить эффективность кастрации и опыления. Мы использовали простой термической обработки с теплой водой для кастрации сопровождении маркировки цветов, которые были emasculaТед устранить семена в результате недавно разработанных цветов после кастрации. После тестирования серию термообработки в разрешительных температурах и изменения длительности погружения в теплой воде, мы создали оптимальную температуру и время продолжительности 48 ° C 3-6 мин. Предрассветный холод лечение было найдено содействовать синхронный опыления в обоих родителей в целях содействия перекрестное опыление. Мы также обсудили ключевые шаги в протоколе и будущего применения этого метода к другим присоединений Setaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важность лечения предрассветной
Чтобы получить высокую частоту скрещивания потомство важно иметь высоко синхронного опыления мужских и женских родителей. Изначально мы ездили на велосипеде температурные режимы и легкие (31 ° С/22 ° С, день / ночь) и использовали S. виридис вступление А10.1 для всех опылений. В этих условиях, большинство цветов открываются рано утром перед температура повышается до 31 ° С, хотя некоторые цветы открыт случайно между 8:00 утра-8: 12 вечера. Предыдущие исследования в S. Италийский показывают, что время суток, место и сезон способствовать изменение в цветения 7,15,16. Силес соавт. 6 отметил, что цветения было связано с резким изменениям температуры и влажности, но не с низкой температурой и высокой влажностью, по сути, заключенным в предыдущих исследованиях 7,15. Поэтому мы использовали предрассветный холод лечение 15 ° С в течение 30 мин (с 8:30-9: 12 утра), чтобы имитироватьестественное состояние предрассветный. Это лечение холодом предрассветный помогал в синхронизации опыления у родителей. Мы наблюдали, что, несмотря установки камеры для относительных уровней влажности 50%, относительная влажность внутри камеры повышается до уровня выше 70%, как температура упала от 22 ° С до 15 ° С и продолжали оставаться выше 70%, пока температура постепенно вырос до 31 ° С, после 9:30. В 9:00 утра, выхолащивается женские родителей и растения отцовского доводятся до лаборатории (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%). Цветы в мужских родителей начинают открываться вокруг 10:10 утра, и опыление может быть выполнена в 10:30 AM-11: 12 утра. Подробный список всех реагентов и оборудования приведены в таблице 2.
Важность подготовки метелки для кастрации
В условиях камеры в этом исследовании (рис. 1), продолжительность основного метелки цветения колебалась от2-3 дня. Как правило, цветы, расположенные на дистальном середине соцветия (2А) открыт первый и открытие предшествует проксимально и дистально. Идеальное количество цветов, которые будут сохранены на метелки 20-30. Внимание должно быть принято во время удаления незрелых цветов так, что только хорошо развитые цветы (самый верхний цветок или большие на колоска 17) сохраняются. Маркировка с красным маркером на обеих сторонах цветов помогает эффективно различать предполагаемый ауткросс потомство из семян из недавно разработанных цветов после кастрации. Кроме того, важно, чтобы оставить щетину на метелки до кастрации, чтобы защитить маленькие цветки от обширного теплового повреждения, однако, в качестве опции, они могут быть удалены после кастрации помощью пружинных ножниц в целях содействия опыление, особенно при связывании метелка метод используется (фиг. 2С и 2D).
Оптимизированная температураПродолжительность г лечение теплом водоподготовки
Основой для кастрации через теплой водой погружением в том, что пыльца является более чувствительным к теплу, чем стигматического поверхности. Тем не менее, продолжительность и температура термообработки могут отличаться для разных Setaria видов и образцов. В общем, выше температуры с более коротким временем лечения или более низкой температуре с более длительным временем обработки будет иметь тот же эффект на кастрации. Было сообщено, что термообработка 42 ° С в течение 20 мин 10 или 47 ° С в течение 10 мин 14 оказывается С. Италийский пыльца нежизнеспособными, но эффективность этих методов лечения не был определен. Мы разработали протокол следующие гипотезы, что при оптимизации температуры и продолжительности лечения, пыльца всех цветов сохраняется на женский родитель будет нежизнеспособным а рыльца останется восприимчивым. Тем не менее, после сравнения и анализа воздействия нескольких температурах ипериоды лечения (табл. 1), мы обнаружили, что чувствительность к термической обработки зависит среди цветов, удерживаемых на каждом метелки, таким образом, трудно полностью исключить семена в результате самоопыления. Мы пришли к выводу, что эффективность производства ауткросс потомство является наибольшей, когда процедуры проводили при 48 ° С в течение 3-6 мин в S. виридис вступление А10.1.
Пик время цветения и перекрестного опыления
Когда цветы достигают зрелости и собираетесь открыть, пыльники желтовато-белый цвет и пыльца пролить как только пыльники exsert из цветов 8. Пыльники постепенно буреют после пыльца пролить как цветы начинают закрываться. После освобождения, жизнеспособность пыльцы неизвестно. Поэтому, очень важно, использовать пыльцу с открытия или недавно открытых цветов на отцовской как можно скорее. В наших условиях камеры (рис. 1), большинство цветочков, цврс от мужских родителей начинают открываться в 10:10 и открытые цветы пролить пыльцу в 10:30. Таким образом, желательно окно для выполнения опыление между 10:30 утра и 11:00. В рыльца остаются вне чешуй за цветами близких и может быть восприимчивым к пыльце. Это было ранее отмечено и подтверждено в S. Италийский, что рыльца восприимчивы около 48 ч после цветочной открытия по Силес др.. 6, поэтому важно, чтобы сумка метелки следующие термообработки и после выполнения контролируемых кресты. Как уже говорилось выше, мы рекомендуем выполнять опыление как на 2-й день и День 3 после кастрации.
Методы опыления
Мы сравнили эффективность трех методов опыления. Если цветущие цветы не являются ограничивающими, метелка к метелки опыление является наиболее эффективным методом и даст большее количество скрещивания потомство. Если цветущие метелки ограничивают, более высокую частоту Outcross потомство будет производиться, когда метод пыльников к стигматизации используется. Мы получили ауткросс потомство от обоих методов успешно. Метод "привязки метелки" был использован в пересечении S. Италийский 6, но мы нашли этот метод наименее эффективный метод, как временное окно для пыльцы пролития отцовского коротка. Кроме того, там меньше контроля над опыления и щетина на S. Viridis метелки может также препятствуют движению пыльцы на стигматического поверхности.
Семя сбор, сушка и хранение
После сбора семена должны быть высушены при 30-33 ° С в течение 2 дней. Anthecium должен быть удален по окрашиванию GUS, если это необходимо. Семена должны храниться в сухом, прохладном месте (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%) для кратковременного хранения (менее двух лет) или в семенной камеры (Т: 4.0- 10 ° C ± 1.0 ° C, относительная влажность: 20% ± 1%) для долговременного хранения.Плохие условия хранения могут привести к низким ставкам жизнеспособности 8. Мы наблюдали, что всхожесть S. виридис A10.1 составляет примерно 5% при посеве через 4 дня после сбора урожая, но может быть увеличено до 90-96% после хранения в лаборатории (Т: 24.06 ° C ± 0,13 ° С, RH: 21,79% ± 1,15%) в течение 110 дней после сбора урожая с последующим трехдневным стратификации при температуре -80 ° С сломать покоя семян. Для стратификации при температуре -80 ° С, сухие семена могут быть размещены в герметичном контейнере (например, микро-центрифуги трубки или монета конверт в запечатанном пластиковом пакете) и выдерживают при температуре -80 ° С в течение 3 дней до посадки. После 16 месяцев хранения в лаборатории (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%), прорастание процент 90-95%, может быть получена. Кроме того, чтобы разорвать покоя, семена можно высушить при 30-33 ° С в течение 2 дней после сбора, а затем дали три дня расслоение при -80 ° С с последующим удалениемanthecium перед посадкой. После такого лечения, семя ставки прорастания до 33% может быть достигнута.
Преимущества, ограничения и возможные модификации
Здесь мы предлагаем первый стандартный протокол для выполнения кресты в S. виридис A10.1 с помощью термической обработки для кастрации. В отличие от физической кастрации, этот протокол является менее инвазивным и относительно легко установить в лаборатории. Обычно это занимает около 15 минут, чтобы обрезать одну метелку и около 15 метелки можно обрезать и пересек / человек / день. Предполагая, в среднем 3-5 скрещивания потомство / метелки могут быть восстановлены в оптимальных условиях, в общей сложности 45-75 скрещивания потомство может быть произведено одним человеком в течение одного дня. Кроме того, этот метод может быть применен к пересекает у других видов Setaria, хотя дополнительные оптимизации будет вероятно. Если камера рост пространство ограничено, растения можно выращивать в теплице или камерах роста без предрассветной сточtment пока метелки не возникает, прежде чем они будут перемещены в оптимизированных условиях камеры.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Sankalpi Warnasooriya и Эми Гумбольдта за критическое прочтение и редактирования рукописи. Эта работа была поддержана грантами от Министерства энергетики (DE-SC0008769) и Национального научного фонда (IOS-1127017).
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. . Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
