In Cross Sahne Yöntemleri<em> Setaris viridis'in</emOtlar için> Yeni Bir Model Sistemi
Summary
Biz Setaris viridis'e (S. viridis) haçları gerçekleştirmek için bir metodoloji geliştirdik. Yöntem, uygun bir polen öldürmek için önce bir sıcak su tedaviye salkım budama içerir. Haçlar iyi-kontrollü bir büyüme rejimi aşağıdaki gerçekleştirilen ve genellikle 1 tohum / s salkımda başına çapraz tozlaşma 7 kurtarma neden vardır.
Abstract
Setaris viridis'in C 4 otların için gelişmekte olan bir model sistem. Yakından biyoenerji yem stoku switchgrass ve tahıl ürün tilki kuyruğu darı ilgilidir. Son zamanlarda, tilki kuyruğu darı, S. 510 Mb genom italica, 1,2 sıralı ve çelimsiz göreli S. 25x kapsama genom dizisi olmuştur viridis sürüyor. S. viridis bunun hızlı bir nesil zaman, küçük boy, basit büyüme gereksinimleri, üretken tohum üretimi 3 ve geçici ve sabit dönüşüm 4 için geliştirilen sistemler de dahil olmak üzere bir potansiyel mükemmel bir model genetik sistemi yapmak özellikleri bir numarası vardır. Bununla birlikte, S. genetik viridis nedeniyle haç gerçekleştirmek için detaylar yöntemlerinin eksikliği, kısmen, büyük ölçüde keşfedilmemiş olan. Bugüne kadar, hiçbir standart protokol kontrollü haçlar tohumlarının hızlı üretime olanak olacağı kabul edilmiştir.
Protokol presodaklılık burada S. genetik haçlar performans için optimize edilmiştir viridis, katılım A10.1. Biz emasculation sonra yeni geliştirilen çiçeklerden kaynaklanan tohumlarını ortadan kaldırmak için 20-30 çiçeği ve çiçek etiketleme korumak için salkım budamadan sonra emasculation için ılık su ile basit bir ısı tedavisi istihdam var. Ilımlı sıcaklıklarda ısıl işlem, bir dizi test edilmesi ve daldırma süresi değişen sonra, 3-6 dakika için bir optimum sıcaklık ve 48 ° C arasında bir zaman aralığı kurduk. Bu yöntemi kullanarak, 15 haç en az günde bir tek bir işçi tarafından yapılabilir ve salkımda başına 3-5 outcross döl arasında bir ortalama geri kazanılabilir. Bu nedenle, 45-75 outcross döl arasında bir ortalama bir gün içerisinde tek bir kişi tarafından üretilebilir. Bu tekniğin geniş uygulama S. rekombinant kendilenmiş hat nüfus gelişimini kolaylaştıracaktır viridis X S. viridis veya S viridis X S. italica, se dökme yoluyla mutasyonlar haritalamagregant analizi ve genetik analiz için yüksek mertebeden mutantlar yaratıyor.
Introduction
S. viridis yakından biyoenerji besleme stok switchgrass (NAD-ME alt tipi), tahıl ürün tilki kuyruğu darı ve tarım ot beç çim 5 ile ilgili bir NADP-ME alt C 4 çim olduğunu. Setaria, S. ekili formunun 510 Mb genom italica, son 1,2 dizilenmiş ve ıskarta nisbetle, S. 25x kapsamı genom sekansı edilmiştir viridis, devam (yayımlanmamış). S. viridis bunun hızlı bir nesil zaman, küçük boy, basit büyüme gereksinimleri ve üretken tohum üretimi dahil olmak üzere 3. bir potansiyel mükemmel bir model genetik sistemi yapmak özellikleri bir numarası vardır. Önemli olan, son şekli S. geçici ve kararlı dönüştürülmesi için geliştirilmiştir transgenik bitkiler 4 oluşturmak için fırsat sağlamak viridis'in. Bununla birlikte, S. genetik araçlar gelişiminde önemli bir darboğaz viridis onun recalc olduğunuoutcross için itrance. Bugüne kadar, standart bir protokol kontrol melezlerinden tohumların üretimine izin hızlı olacağı yayınlanmıştır.
S. Genetik haçlar italica genellikle çiçek 6,7,8 gelen anterlerin çıkarılması yoluyla ya da kadın anne 9-11 çiçek ısıl işlem yoluyla emasculation tarafından yapılmaktadır. Bu tedaviler, anterlerdeki veya non-işlenmiş çiçek Panicles aşağıdaki / erkek anne hafifçe polen serbest stigmas karşı aşındırılmaktadır. Emasculation yılında, anterler çiçekçik açar ve anter exsert başlıyor hemen sonra ince forseps kullanarak kaldırılır, ancak henüz polen 6-8 döken değil. Bu son bahsedilen yöntemin başka sorunlar arasında çiçek açma ve polen dökülmesi arasında dar bir zaman aralığında yumuşatma yerine güçlüğüdür. Tek bir çiçek açma ve kapama süresi katılım ve çevre koşullarına bağlı olarak değişir, ve 7 dakika arasında olabilir <sup> 6 S. 12 saat, 2.5 italica. Anterler çiçekçik itibaren exsert olarak polen dökülme oluşur yana, anterler dikkatli ve hızlı bir şekilde kaldırılması gerekir, ve bu nedenle, nedeniyle kendini tozlaşma kirlenmesini önlemek zordur. Tozaklamalar emasculation hemen sonra yapılır ek olarak, günde / kişi başına yapılabilir haçlar sayısı sınırlıdır.
Alternatif bir yöntem olarak, olgun salkımları ısı-öldürmek Panicles çok sayıda haç yerine avantajı ile polen tanelerini 9,10,13,14 gelişmekte ılık suya batırılmış olabilir. Fakat, ısıl işlem sıcaklığı ve süresi, farklı deneyler için (20 dakika 10 10 dakika 14 ve 42 ° C, örneğin 47 ° C) arası değişir. Bundan başka, ısı aracılı emasculations etkinliği üzerinde herhangi bir sistematik analiz yayınlanmıştır. S. genetik haç gerçekleştirmek için Böylece, standart ve basit bir yöntem viridis ölçüde S. genetik kaynak geliştirme ve kuruluş hızlanacak araştırma toplum içinde bir model sistem olarak viridis'in.
Biz S. genetik haçlar gerçekleştirmek için standart bir protokol geliştirme ve optimizasyon rapor viridis. Bitkiler çiçek gelişimini senkronize ve prosedürün tekrarlanabilirliği arttırmak için kontrollü ortamlarda altında yetiştirilir. Aşan bir transgenik S. kullanılarak yapılmaktadır Başarılı kontrollü genetik haçlar tanımlanmasını kolaylaştırmak için GUS raportör genini içeren 4 erkek ebeveyn olarak viridis'in hattı. GUS transgen hemen hasat sonrası F1 tohumu puanlama sağlar ve böylece emasculation ve polenleşme etkinliğini belirlemek için kolay bir kalitatif analizi sağlayan bir pirinç ubikutin promotör ile tahrik edilir. Biz emascula olmuştur çiçek etiketleme eşliğinde emasculation için ılık su ile basit bir ısı tedavisi istihdam varted emasculation sonra yeni geliştirilmiş çiçeklerden elde edilen tohum ortadan kaldırmak için. Ilımlı sıcaklıklarda ısıl işlem, bir dizi test edilmesi ve ılık suda daldırma süresi değişen sonra, 3-6 dakika ila 48 ° C'lik bir optimum sıcaklık ve zaman süreleri kurduk. Bir şafaktan soğuk tedavi çapraz tozlaşma kolaylaştırmak amacıyla her iki ebeveyn de senkron anthesis'e teşvik bulundu. Biz de diğer setaria katılımların için protokol ve bu yöntemin gelecekte uygulamasında önemli adımlar tartıştık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şafak tedavinin önemi
Outcross döl yüksek bir frekans elde etmek için bu erkek ve kadın ebeveynlerin yüksek senkron anthesis'e olması esastır. Başlangıçta, sıcaklık ve ışık rejimleri sağlanıncaya (31 ° C/22 ° C, gündüz / gece) ve S. kullanılan Tüm döllemeden için viridis'in katılım A10.1. 12:00: sıcaklığı 31 ° C'ye yükselir önce bu şartlar altında, çoğu çiçekler birkaç çiçek açık olsa rastgele 08:00-8 arasında, sabah erken açın. S. Önceki çalışmalar italica günün o zaman gösterir, yer ve sezon anthessiten 7,15,16 çeşitlilikten katkıda bulunur. Siles vd. 6. önceki çalışmalarda 7,15 sonucuna gibi Anthesis, sıcaklık ve nem oranı değişiklikleri ile ilişkili değil, düşük sıcaklık ve yüksek nem ile, başına olduğunu kaydetti. Taklit etmek için: Bu nedenle, (12:00 08:30-9), 30 dakika boyunca 15 ° C arasında bir ön-şafak soğuk tedavi kullanılırdoğal şafak durum. Bu ön-şafak soğuk tedavi ebeveynlerde anthesis'e senkronize destekli. Biz,% 50 bağıl nem seviyesi için ayar haznesi rağmen, haznenin içindeki bağıl nem, sıcaklık 15 ° C ila 22 ° C düştü% 70 üzerinde bir seviyede yükselmiştir ve sıcaklık derecesine kadar% 70 üzerinde kalmaya devam ettiği görülmektedir yavaş yavaş 09:30 sonra 31 ° C'ye yükseldi. 09:00 anda, kadın anne hadım ve erkek ebeveyn bitkileri laboratuara getirilir (T: 1.15% ± 21.79%: 24.06 ° C 0,13 ° C, RH ±). Erkek velilere Çiçekleri 10:10 civarında başlanır ve tozlaşma 10:30-11'de yapılabilir: 12:00. Tüm reaktifler ve ekipman ayrıntılı bir listesini Tablo 2'de verilmiştir.
Emasculation için salkım hazırlama önemi
Bu çalışmada, (Şekil 1) 'de oda koşulları altında, birinci salkım çiçeklenme süresi arasında değişmiştir2-3 gün. Tipik olarak, (Şekil 2A) açık ilk ve açılış öncesinde proksimal ve distalde çiçeklenme uzak ortasında bulunan çiçekler. Salkımda saklandığı çiçek ideal sayı 20-30. Sadece iyi gelişmiş çiçekler (başakçık 17 üstteki çiçek veya büyük) korunur böylece Dikkat olgunlaşmamış çiçek çıkarılması sırasında alınmalıdır. Çiçeklerin her iki kırmızı işaret ile etiketleme verimli emasculation sonra yeni geliştirilmiş bir çiçek tohumları, varsayılan outcross döl ayırmak için yardımcı olur. Buna ek olarak, geniş ısı hasar çiçeklerini korumak için emasculation önce Panicles üzerindeki kıllar bırakmak için önemlidir, ancak bir seçenek olarak, bir salkım bağlama, özellikle tozlaşma kolaylaştırmak amacıyla yaylı makas kullanılarak emasculation sonra kaldırılabilir tekniği (Şekiller 2C ve 2D) kullanılır.
Optimize edilmiş bir sıcaklıkSıcak su arıtma d tedavi süresi
Sıcak su daldırma yoluyla emasculation için temeli polen stigmatik yüzeyinden daha ısıya daha duyarlı olmasıdır. Ancak, süresi ve ısıl işlem sıcaklığı setaria türler ve katılımların arasında değişebilir. Genel olarak, daha kısa bir tedavi süresi veya daha uzun bir işleme süresi ile daha düşük bir sıcaklık daha yüksek bir sıcaklık emasculation üzerinde aynı etkiye sahip olacaktır. Bu rapor edilmiştir ki, 20 dakika 10 ya da 10 dakika boyunca 47 ° C'de 14 işlenen S. boyunca 42 ° C'lik bir ısı işlemi italica polen yaşayabilir olmayan, ancak bu tedavilerin etkinliği tespit edilememiştir. Biz bir tedavi optimize edilmiş sıcaklık ve süresi altında, tüm çiçeklerin polen stigmas açık kalır ise dişi ebeveyn cansız olacak tutulan bu hipotezi aşağıdaki bizim protokol geliştirdik. Ancak, çeşitli sıcaklık etkilerini karşılaştırma ve analiz ettikten sonra veTedavi dönemleri (Tablo 1), biz bu nedenle tamamen kendi kendine döllenmeden kaynaklanan tohum ortadan kaldırmak zordur, ısıl işleme duyarlılık her salkımda tutulan çiçekler arasında farklılık bulundu. Bu tedaviler S. 3-6 dakika boyunca 48 ° C 'de gerçekleştirilen zaman outcross soyu üretme verimi büyük olduğu sonucuna viridis katılım A10.1.
Anthessiten ve çapraz tozlaşma puant
Çiçekler olgunluğa ulaşmak ve açmak üzereyken, anterler sarımsı beyaz renklidir ve polen gibi kısa sürede anterler çiçeklerden 8 exsert olarak dökülür. Çiçekler kapatmak başladığınızda polen döken sonra Başçıklar yavaş yavaş kahverengi açmak. Bir kez yayımlanan, polen canlılığı bilinmemektedir. Bu nedenle, kısa sürede erkek ebeveyn açılmasını veya taze açılan çiçeklerden polen kullanmak önemlidir. Bizim oda koşullarında (Şekil 1), flowe çoğunluğu altındaerkek ebeveynlerin rs 10:10 açılmaya başlar ve açılmış çiçekler 10:30 de polen döken. Böylece, tozlaşma gerçekleştirmek için istenen pencere 10:30-11:00 olduğunu. Stigmas yakın çiçeklerden sonra kavuzludur dışında kalır ve polen açık olabilir. Bu, daha önce gözlenen ve S. doğrulanmıştır italica stigmas Siles vd. 6 ile yaklaşık 48 saat sonrası çiçek açılması için açık olan, bu nedenle ısıl işlem aşağıdaki çanta Panicles önemli ve kontrollü haçlar yaptıktan sonra olduğunu. Yukarıda tartışıldığı gibi, biz Gün 2 ve 3. Gün sonrası emasculation hem performans tozaklamalar öneririz.
Tozlaşma için yöntemler
Üç tozlaşma teknikleri etkinliğini karşılaştırılmıştır. Çiçeklenme çiçekler sınırlayıcı değilseniz, salkım-to-salkımda tozlanma en verimli bir tekniktir ve outcross döl daha yüksek bir sayı verecektir. Çiçeklenme salkımları, o bir yüksek frekans sınırlayıcı iseanter to-leke yöntemi kullanıldığı zaman, projeni utcross üretilecektir. Biz başarılı bir şekilde hem yöntemlerinden outcross soyu almış. "Bağlayıcı ekspresyona tabi tutulması" yöntemi S. geçiş kullanılmıştır italica 6 ama biz erkek ebeveynin polen dökülme için zaman penceresi kısa olan bu yöntem en etkili yöntem olarak bulundu. Ayrıca, daha az tozlanma üzerinde kontrol ve S. üzerindeki kıllar var viridis salkımları da mercek yüzeyine polen hareketini engelleyebilir.
Tohum hasat, kurutma ve depolama
Ürünün toplanmasından sonra, tohumlar, 2 gün boyunca 30-33 ° C'de kurutulur olmalıdır. Gerekirse Anthecium, GUS boyama için kaldırılmalıdır. Tohumlar kuru, serin bir yerde muhafaza edilmelidir (T: 1.15% ± 21.79%: 24.06 ° C 0,13 ° C, RH ±) T (kısa süreli depolama (iki yıldan az) veya bir tohum odasında: 4.0- Uzun süreli depolama için% 20 ±% 1): 10 ° C 1.0 ° C, RH ±.Kötü depolama koşulları, düşük canlılık oranları 8 neden olabilir. Biz gözlemledim ki S. çimlenme oranı viridis A10.1 4 gün sonra hasat ekilir zaman, yaklaşık% 5, ancak laboratuar (T% 1.15 ±% 21.79: 24.06 ° C 0.13 ° C, RH ±) muhafaza edildikten sonra,% 90-96 kadar arttırılabilir 110 için gün sonrası hasat Çimlenme kırmak için -80 ° C'de üç günlük bir tabakalaşma izledi. -80 ° C de katlama, kuru tohumlar hava geçirmez bir kapta (örneğin, mikro santrifüj tüpü ya da kapalı bir plastik torba içinde para zarf) yerleştirilebilir ve ekimden önce 3 gün süreyle -80 ° C'de tutulmuştur. Laboratuvarda depolama alanı 16 ay sonra (T: 24.06 ° C 0.13 ° C, RH ±:% 1.15 ±% 21.79),% 90-95 arasında çimlenme yüzdesi yine de elde edilebilir. Buna ek olarak, dinlenmesi kırmak için, tohum hasat sonra 2 gün boyunca 30-33 ° C'de kurutulabilir, ve bundan sonra da bunu takiben -80 ° C'de üç günlük bir tabakalaşma verilmişanthecium önce dikim. Bu işlemlerden sonra,% 33'e varan tohum çimlenme oranları elde edilebilir.
Avantajları, sınırlamaları ve olası değişiklikler
Burada S. haçlar gerçekleştirmek için ilk standart protokol sağlar emasculation için bir ısıl işlem ile viridis A10.1. Fiziksel emasculation aksine, bu protokol daha az invaziv ve bir laboratuar kurmak için nispeten kolaydır. Bu genellikle bir salkım kırpmak için yaklaşık 15 dakika sürer ve yaklaşık 15 salkımları kesilmiş ve / kişi / gün geçilebilir. 3-5 outcross döl / salkımda ortalama varsayarsak optimum şartlarda elde edilebilir, 45-75 outcross döl toplam tek bir günde bir kişi tarafından üretilebilir. Ayrıca, bu teknik, büyük olasılıkla da optimize olacak olsa da, diğer Setaria türlerde geçer uygulanabilir. Büyüme odası alanı sınırlı ise, bitkiler bir şafaktan Akne tedavi edici olmadan yeşil ev veya büyüme odalarında yetiştirilen olabilironlar optimize odacık koşullarına taşınmış önce salkım çıkana kadar tment.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma ve düzenleme için Sankalpi Warnasooriya ve Amy Humboldt teşekkür ederim. Bu çalışma, Enerji Bakanlığı (DE-SC0008769) ve Ulusal Bilim Vakfı (IOS-1127017) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. . Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
