に十字架を実行するためのメソッド<em>エノコログサ</em草のために>、新モデルシステム
Summary
私たちは、 エノコログサ（S.エノコログサ ）で十字を実行するための方法論を開発しました。方法は、従来の実行可能な花粉を殺すために熱水処理に穂を剪定することを含む。 ×印は、よく制御された成長政権後に実施し、典型的には、1穂当たりの種子/ Sクロス受粉7の回復につながるされています。
Abstract
エノコログサは、C 4草のための新たなモデル系である。それは密接にバイオエネルギー供給原料スイッチグラスや穀物作物のアワに関連しています。最近では、アワ、Sの510 Mbのゲノムイタリカは、1,2および雑草相対Sの25Xカバレッジゲノム配列を配列決定されているエノコログサが進行中である。S.エノコログサは迅速な生成時間を含め、潜在的に優れたモデル遺伝系、小柄、単純な増殖要件、多作種子の生産3にし、一過性および安定な形質転換4の両方のためのシステムを開発した多くの特性を持っています。しかし、Sの遺伝学エノコログサは、交配を実施するための詳細な方法がないために、部分的には、大部分が未開拓である。現在まで、標準的なプロトコルは、制御された交雑種子の急速な生産を可能にすることが採択されていない。
プロトコル圧力取得済みはここでSに遺伝的交雑を実行するために最適化されていますエノコログサ 、アクA10.1。私たちは、除雄後に新たに開発された花から生じた種を除去するために、花の20〜30小花とラベルを保持するために穂を剪定した後に骨抜き用の温水で簡単な熱処理を採用している。許容温度での一連の熱処理をテストし、浸漬の持続時間を変える後、我々は3-6分間、最適温度および48°Cの時間範囲を確立した。この方法を用いて、15×印の最小一日ごとに1回の作業者が行うことができ、穂当たり3-5異系交配子孫の平均を回収することができる。したがって、45-75異系交配子孫の平均は、1日に1人により製造することができる。この技術の広範な実装はS.の組換え近交系集団の発達を促進するエノコログサ X S.エノコログサまたはSエノコログサ X S.イタリカ 、SEバルクを通じて変異をマッピングするgregant解析と遺伝子解析のための高次の変異体を作成する。
Introduction
S.エノコログサ密接バイオエネルギー供給原料スイッチグラス（NAD-MEのサブタイプ）、穀物作物のアワ、農業雑草ギニアグラス5に関連する、NADP-MEサブタイプC 4草です。 エノコログサ、Sの栽培形の510 Mbのゲノムイタリカは、最近になって、1,2および雑草相対、Sの25Xカバレッジゲノム配列を配列決定されているエノコログサは 、進行中である（未発表）。S.エノコログサは迅速な生成時間を含め、潜在的に優れたモデル遺伝系、小柄、単純な増殖要件、および多産の種子生産3にする多くの特性を持っています。重要なことに、最近の方法はS.の両方で安定した一過性形質転換のために開発されているトランスジェニック植物4を作成するための機会を提供するエノコログサ 。しかし、S.のための遺伝的ツールの開発における主なボトルネックエノコログサは、再計算され他殖にitrance。現在まで、標準的なプロトコルは、制御された交雑種子の急速な生産を可能にすることが発表されていない。
S内遺伝的交雑イタリカは通 常、花が6,7,8から葯の除去を介して、または、女性の両親9月11日の花の熱処理によって骨抜きによって実行されます。これらの治療、葯または無処理の花から穂次/オス親が優しく花粉を解放柱頭に対して摩耗している。骨抜きでは、葯は小花が開き、葯を突き出すし始めた直後に細かい鉗子を用いて除去しているが、まだ花粉6-8を流していない。この後者の方法の課題の中でも、花の花粉杼口開口部との間の狭い時間間隔で除雄を行うことが困難である。単一の花の開閉の持続時間は、受託及び環境条件に依存して変化し、7分間の範囲であることができる<S内SUP> 6から2.5時間12 イタリカ 。葯の小花から突き出すように花粉の脱落が発生するため、葯を慎重かつ迅速に除去する必要があるので、それは、自家受粉による汚染を回避することは困難である。受粉を除雄直後に実行されるようにまた、日あたり/人ごとに実行することができる交雑の数は限られている。
別の方法としては、成熟した穂を熱殺すために穂が多数に十字架を実施することの利点と花粉9,10,13,14の開発、暖かい水に浸漬することができます。しかし、熱処理の温度及び時間は、異なる実験（20分10 10分14および42℃用など 47℃）から大きく異なる。さらに、熱媒介emasculationsの有効性に関する系統的な分析が発表されていない。 Sに遺伝的交雑を実行するためのように、標準的で簡単な方法V虹彩が大幅にSの遺伝資源の開発と確立を加速する研究コミュニティ内でのモデル系として、 エノコログサ 。
我々はSに遺伝的交雑を実行するための標準プロトコルの開発と最適化を報告エノコログサ 。植物が花の発生を同期させ、手順の再現性を高めるために制御された環境下で成長させる。十字架は、トランスジェニックSを使用して実行される成功した制御された遺伝的交雑の同定を容易にするために、GUSレポーター遺伝子を含有する4雄親としてエノコログサ線 。 GUSトランスジーンは、収穫後直ちにF1種子のスコアリングを可能にし、従って、除雄と受粉の効率を決定するための簡単な定性アッセイを提供するイネユビキチンプロモーターによって駆動される。我々はemasculaていた花のラベル付けを伴う骨抜き用の温水で簡単な熱処理を採用している除雄後に新たに開発された花から生じた種を排除するためのテッド。許容温度で加熱処理する一連のテストをしてぬるま湯に浸すの期間を変化させた後、我々は3-6分から48℃の最適な温度と時間の期間を設けています。夜明け前の低温処理は、他家受粉を促進するために、両方の親における同期開花を促進することが見出された。我々はまた、プロトコルや他のエノコログサアク 、このメソッドの将来のアプリケーションにおける重要なステップについて説明してきました。
Protocol
Representative Results
Discussion
夜明け前治療の重要性
異系交配後代の高い周波数を得るためには、男性と女性の両親の高度同期開花が不可欠です。最初に、我々は、温度と光体制を再投入（31°C/22°C、昼/夜）およびSを使用すべての受粉用エノコログサアク A10.1。 00時：温度が31℃まで上昇する前にこれらの条件の下では、ほとんどの花はいくつかの花のオープンもランダムに8:00 AM-8との間で、早朝に開きます。 S内の以前の研究場所と季節が開花7,15,16の変化に寄与し、その日のその時間を示しているイタリカ 。シレスら 6は、従来の研究7,15年に締結ように開花は、それ自体が、低温、多湿で急激な温度変化や湿度ではなく、関連していたことを指摘した。模倣する：したがって、我々は（00 AM 8:30-9から）30分間15℃の夜明け前低温処理を採用自然な夜明け前の条件。この夜明け前の低温処理は、両親に開花を同期で支援。私たちは、50％の相対湿度レベルの室を設定にもかかわらず、チャンバー内の相対湿度は温度に達するまで温度が15℃まで22℃から低下し70％以上の水準に上昇し、70％を超える滞在し続けたことを観察した徐々に9:30後に31℃まで上昇した。午前9時、男性の親の雌の親や植物を去勢は研究室にもたらされる（T：21.79パーセント±1.15％：24.06℃、0.13℃、相対湿度を±）。男性の両親の花が10:10の周りの開口部を起動し、受粉10:30 AM-11で行うことができます：00午前。すべての試薬 および装置の詳細なリストを表2に設けられている。
骨抜き用の穂の準備の重要性
この研究（ 図1）内のチャンバ条件下では、一次穂ブルーミングの持続時間があったから2〜3日。一般的に、花序の先端真ん中に位置して花（ 図2A）は、最初のオープンと開口部が近位および遠位に先行する。穂上に保持される花の理想的な数は、20〜30である。唯一のよく発達した花（小穂17上の一番上の花や最大）が保持されるよう注意が未熟な花を除去する際に注意が必要です。花の両側に赤いマーカーで標識を効率的に骨抜きした後に新たに開発された花から種子から推定される異系交配の子孫を区別するのに役立ちます。また、大規模な熱損傷から小花を保護するために骨抜き前に穂に剛毛を残すことが重要であるが、オプションとして、それらは、穂結合する場合は特に、受粉を促進するために、スプリングのはさみを使用して除雄後に除去することができる技術は、（ 図2Cおよび2D）を用いる。
最適化された温度AN温水処理のためのd個の治療期間
温水浸漬を通して除雄の基本は、花粉が柱頭表面より熱に敏感であるということです。しかし、熱処理の持続時間と温度がセタリア種やアクの間で異なる場合があります。一般に、より長い処理時間が短い処理時間またはより低い温度でより高い温度が骨抜きに対して同じ効果を有するであろう。これは、報告されている20分10又は10分間47℃C 14レンダリングS. 42℃の熱処理イタリカ花粉非生存が、これらの処理の効率が決定されなかった。我々は、治療の最適化された温度及び時間の下で、すべての花の花粉が柱頭に受容残るながら女性の親が生育不能になる上に保持するという仮説次の我々のプロトコルを開発した。しかしながら、いくつかの温度の効果を比較し、分析した後と治療期間（ 第1表 ）、我々は、このようにそれが完全に自家受粉から得られた種子を除去することは困難であり、熱処理に対する感度が各穂上に保持され、花の間で変化することを見出した。我々は、治療がS.中3-6分間、48℃で実施されるとき異系交配子孫を生産する効率が最大であると結論エノコログサアク A10.1。
開花と他家受粉のピーク時
花が成熟に達すると開くしようとしている場合には、葯の色は黄色がかった白であり、花粉とすぐ葯花8から突き出すように流されている。花が閉じ始めるように花粉が流された後に葯は徐々に茶色に。リリースされたら、花粉の生存率は不明である。そのため、できるだけ速やかに男性の親の開口部または新鮮に開いた花から花粉を使用することが重要です。私たちのチャンバの状態（ 図1）、floweの大半の下で男性の両親のRSは10:10で開くように開始し、開いた花は午前10時30分で花粉を流した。このように、受粉を行うために望ましいウィンドウは10:30と11:00の間にある。柱頭は近くの花の後に穎の外に残り、花粉を受け入れるかもしれません。これは、以前に観察され、S.確認されているイタリカ柱頭がシレスら 6から約48時間後に開花のために受け入れているので、それは熱処理後バッグ穂にとって重要かつ制御十字架を実行した後であること。上述したように、私たちは2日目と3日目後の除雄の両方で受粉を行ってお勧めします。
受粉のための方法
我々は3つの受粉技術の効率を比較した。花が咲く限定されていない場合は、穂から穂受粉は、最も効率的な技術であり、異系交配の子孫の数が多いが得られる。開花穂は、Oの高い周波数を制限している場合葯から柱頭法を用いた場合utcross子孫が生成される。我々が正常に両方の方法から異系交配の子孫を取得しています。 「バインディング穂」の方法は、Sを横切るで使用されている男性の親の花粉脱落のための時間ウィンドウが短いようイタリカ 6が、我々は、この方法が最も効率的な方法であることが判明。また、あまり受粉を制御し、S上の毛がありますエノコログサの穂も柱頭表面に花粉の動きを妨げることがあります。
種子の収穫、乾燥、ストレージ
収穫後、種子を2日間30〜33℃で乾燥されるべきである。必要に応じてAntheciumは、GUS染色のために削除する必要があります。種子は、乾燥した涼しい場所に保管してください（T：1.15％±21.79パーセント：24.06°Cで、0.13℃、相対湿度を±）、T（短期保存（二年未満）、またはシードチャンバー内：4.0 – 長期保存のために20％±1％）：10°Cで、1.0℃、相対湿度を±。貧弱な貯蔵条件は、低い生存率8をもたらし得る。私たちは、観察したことをSの発芽率エノコログサ A10.1 の 4日後に収穫播種時約5％であるが、実験室で貯蔵した後90から96パーセントまで増加させることができる（T：21.79パーセント±1.15％：24.06°Cで0.13°C、RH、±）110日後に収穫種子休眠を打破するために-80℃で3日間の層別化した。 -80℃での層別化のために、乾燥した種子は、気密容器（ 例えば 、マイクロ遠心管又は密封されたビニール袋コインエンベロープ）に配置することができ、植え付けの前に3日間、-80℃で維持した。実験室でのストレージの16ヶ月後（T：24.06°Cが0.13℃、相対湿度：±1.15％±21.79パーセント）を、90から95パーセントの発芽率は、依然として得ることができる。また、休眠を破るために、種子は、収穫後2日間、30〜33℃で乾燥させることができ、その後の除去に続いて-80°Cで3日間与えられた成層anthecium前に植える。これらの処理の後、最大33％の発芽率を達成することができる。
利点、制限および可能な修正
ここでは、S.に交配を行うための第1の標準プロトコルを提供骨抜きのための熱処理を使用して、 エノコログサの A10.1。物理的除雄とは対照的に、このプロトコルは、低侵襲性及び研究室で確立することが比較的容易である。これは通常、1穂をトリミングするのに約15分かかり、約15穂をトリミングおよび/人/日、交差することができます。 45-75異系交配子孫の合計は一日に一人で製造することができ、異系交配子孫3-5 /円錐花序の平均値を仮定すると最適化された条件下で回収することができる。さらに、この技術は、追加の最適化が可能性が高いだろうが、他のセタリア種で交差するように適用することができる。成長室空間が限られている場合、植物は、夜明け前トリートメントルーム、ことなく、温室またはグロースチャンバー中で増殖させることができるこれらは最適化されたチャンバの状態に移動される前に、穂が出てくるまでtment。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の重要な読書および編集のためSankalpi Warnasooriyaとエイミーフンボルトに感謝します。この作品は、エネルギー省（DE-SC0008769）、国立科学財団（IOS-1127017）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. . Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
