طرق لإجراء الصلبان في<em> الهلبانة البلدي</em>، نظام نموذج جديد للأعشاب
Summary
قمنا بتطوير منهجية لأداء الصلبان في VIRIDIS الهلبانة (S. البلدي). ينطوي على طريقة التقليم باقه ورد قبل العلاج الماء الساخن لقتل حبوب اللقاح قابلة للحياة. يتم تنفيذ الصلبان التالية نظام النمو تسيطر عليها بشكل جيد، ويؤدي عادة في الانتعاش من 1-7 عبر التلقيح بذرة / ثانية لكل باقه ورد.
Abstract
الهلبانة البلدي هو نظام نموذجي الناشئة لC 4 الأعشاب. يرتبط ارتباطا وثيقا إلى تغذية الطاقة الحيوية التبن الأسهم ومحصول الحبوب ذيل الثعلب الدخن. في الآونة الأخيرة، الجينوم 510 ميغابايت من الدخن ذيل الثعلب، S. ITALICA، وقد التسلسل 1،2 و25X تغطية تسلسل الجينوم للS. النسبية الأعشاب الضارة VIRIDIS قيد التقدم. S. VIRIDIS لديها عدد من الخصائص التي تجعل من نموذج نظام الوراثية يحتمل ممتازة بما في ذلك الوقت جيل السريع، مكانة صغيرة، ومتطلبات النمو بسيطة، وإنتاج البذور وافرة 3 والنظم التي وضعت لكلا عابرة ومستقرة التحول 4. ومع ذلك، فإن علم الوراثة من S. VIRIDIS هو غير مستكشفة إلى حد كبير، في جزء منه، وذلك بسبب عدم وجود طرق مفصلة لأداء الصلبان. حتى الآن، لم يتخذ بروتوكول قياسي من شأنها أن تسمح الإنتاج السريع للبذور من الصلبان التي تسيطر عليها.
وبريه بروتوكولented هنا هو الأمثل لأداء الصلبان الجينية في S. VIRIDIS، الانضمام A10.1. لقد استخدمنا المعالجة الحرارية بسيطة مع الماء الدافئ لخصاء بعد تشذيب باقه ورد للاحتفاظ 20-30 زهيرات ووضع العلامات من الزهور للقضاء على البذور الناتجة من الزهور وضعت حديثا بعد خصاء. بعد اختبار سلسلة من المعالجات الحرارية في درجات حرارة متفاوتة ومتساهلة مدة غمس، أنشأنا درجة الحرارة المثلى والنطاق الزمني من 48 درجة مئوية لمدة 3-6 دقيقة. باستخدام هذا الأسلوب، ما لا يقل عن 15 الصلبان يمكن أن يقوم بها عامل واحد في اليوم وبمتوسط 3-5 ذرية هجين الأباعد في الدالية يمكن استردادها. لذلك، في المتوسط 45-75 ذرية هجين الأباعد يمكن أن تنتج من قبل شخص واحد في يوم واحد. وتنفيذ واسعة من هذه التقنية تسهيل وضع السكان السلالة النقية المؤتلف من S. VIRIDIS X S. VIRIDIS أو S. VIRIDIS X S. ITALICA، تعيين الطفرات من خلال الجزء الأكبر ذاتهاتحليل gregant وخلق المسوخ العليا للتحليل الجيني.
Introduction
S. VIRIDIS هو NADP-ME النوع الفرعي C 4 العشب ترتبط ارتباطا وثيقا تغذية الطاقة الحيوية التبن الأسهم (NAD-ME النوع الفرعي)، محصول الحبوب ذيل الثعلب الدخن، والحشائش الزراعية غينيا العشب 5. الجينوم 510 ميغابايت من شكل المزروعة الهلبانة، S. ITALICA، وقد تم مؤخرا التسلسل 1،2 و25X تغطية تسلسل الجينوم من النسبية الأعشاب الضارة، S. VIRIDIS، هو في التقدم (غير منشورة). S. VIRIDIS لديها عدد من الخصائص التي تجعل من نموذج نظام الوراثية يحتمل ممتازة بما في ذلك الوقت جيل السريع، مكانة صغيرة، ومتطلبات النمو بسيطة، وإنتاج البذور وافرة 3. الأهم من ذلك، وقد تم مؤخرا تطوير أساليب لكلا التحول عابرة ومستقرة من S. VIRIDIS التي توفر الفرصة لخلق النباتات المعدلة وراثيا 4. ومع ذلك، عقبة رئيسية في تطوير الأدوات الوراثية للS. VIRIDIS هو recalc لهاitrance إلى التهجين. حتى الآن، وقد تم نشر أي بروتوكول قياسي من شأنها أن تسمح الإنتاج السريع للبذور من الصلبان التي تسيطر عليها.
الصلبان الجينية في S. عادة ما يتم تنفيذها من قبل ITALICA خصاء من خلال إزالة المتك من الزهور 6،7،8 أو من خلال المعالجة الحرارية من الزهور من الآباء والأمهات الإناث 9-11. بعد هذه العلاجات، المتك أو عناقيد من الأزهار غير المعالجة / الآباء الذكور ومتآكل بلطف الوصمات ضد الإفراج عن حبوب اللقاح. في خصاء، تتم إزالة المتك باستخدام ملقط غرامة على الفور بعد فتح floret غاضب والعضو الذكري هو بداية لexsert، ولكن لم تسلط بعد اللقاح 6-8. من بين التحديات التي تواجه هذا الأسلوب الأخير هو صعوبة في أداء خصاء في فترة زمنية ضيقة بين فتح وتسليط حبوب اللقاح من زهرة. ومدة فتح وإغلاق زهرة واحدة تختلف تبعا لحالة الانضمام والبيئية، ويمكن أن تتراوح بين 7 دقائق <سوب> 6-2،5 ساعة في 12 S. ITALICA. منذ سفك حبوب اللقاح كما يحدث exsert المتك من floret غاضب، تحتاج المتك إلى إزالتها بعناية وبسرعة، وبالتالي، فمن الصعب تجنب التلوث بسبب التلقيح الذاتي. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم تنفيذ pollinations مباشرة بعد خصاء، وعدد من الصلبان التي يمكن القيام بها للشخص الواحد / في اليوم الواحد محدودة.
كطريقة بديلة، عناقيد ناضجة يمكن مغموسة في الماء الدافئ لتسخين القتل تطوير حبوب اللقاح 9،10،13،14 مع الاستفادة من أداء الصلبان على عدد كبير من عناقيد. ومع ذلك، فإن درجة الحرارة ومدة المعالجة الحرارية تختلف على نطاق واسع من التجارب المختلفة (على سبيل المثال 47 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة 14 و 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة 10). علاوة على ذلك، لم تنشر تحليلات منهجية على فعالية الإخصاء بوساطة الحرارة. وبالتالي، وهو معيار وطريقة بسيطة لأداء الصلبان الجينية في S. الخامسالقزحية من شأنه أن يعجل بشكل كبير تنمية الموارد الوراثية وإنشاء S. VIRIDIS كنظام نموذج داخل المجتمع البحثي.
نفيدكم تطوير وتعظيم الاستفادة من بروتوكول قياسي لأداء الصلبان الجينية في S. VIRIDIS. تزرع النباتات في بيئات تسيطر عليها لمزامنة تنمية زهرة وزيادة استنساخ الإجراء. يتم تنفيذ الصلبان باستخدام S. المعدلة وراثيا خط VIRIDIS كما ذكر الوالد الذي يحتوي على الجين مراسل المكتب المركزي للاحصاءات 4 لتسهيل التعرف على الصلبان ناجحة الجينية التي تسيطر عليها. هو الدافع وراء التحوير من قبل المكتب المركزي للاحصاءات اليوبيكويتين المروج الأرز والتي تمكن من التهديف بذور F1 فورا بعد الحصاد، وبالتالي يوفر الفحص النوعي من السهل تحديد كفاءة خصاء والتلقيح. لقد استخدمنا المعالجة الحرارية بسيطة مع الماء الدافئ لخصاء يرافقه وضع العلامات من الزهور التي كانت emasculaتيد للقضاء على البذور الناتجة من الزهور وضعت حديثا بعد خصاء. بعد اختبار سلسلة من المعالجات الحرارية في درجات حرارة متفاوتة ومتساهلة مدة غمس في الماء الدافئ، وأنشأنا درجة الحرارة والوقت الأمثل فترات من 48 درجة مئوية 3-6 دقيقة. تم العثور على علاج البرد قبل الفجر لتعزيز anthesis متزامن في كل من الآباء والأمهات من أجل تسهيل عبر التلقيح. ناقشنا أيضا الخطوات الرئيسية في البروتوكول وتطبيقها في المستقبل من هذا الأسلوب لانضمام الهلبانة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهمية العلاج قبل الفجر
للحصول على وتيرة عالية من ذرية هجين الأباعد فمن الضروري أن يكون anthesis متزامن للغاية من الآباء الذكور والإناث. في البداية، ونحن تدوير الأنظمة درجة الحرارة والضوء (31 ° C/22 ° C، اليوم / ليلة) واستخدمت S. VIRIDIS الانضمام A10.1 لجميع pollinations. في ظل هذه الظروف، فإن معظم الزهور فتح في الصباح الباكر قبل ارتفاع درجات الحرارة إلى 31 درجة مئوية، على الرغم من بعض الزهور مفتوحة بشكل عشوائي بين الساعة 8:00 AM-8: 00 AM. دراسات سابقة في S. ITALICA تشير إلى أن الوقت من اليوم، والموقع والموسم تسهم في الاختلاف في anthesis 7،15،16. سيليس وآخرون. احظت أن 6 anthesis كان مرتبطا مع التغيرات السريعة في درجات الحرارة والرطوبة، ولكن ليس مع انخفاض درجة الحرارة والرطوبة العالية، في حد ذاته، كما اختتمت في الدراسات السابقة 7،15. لذلك، قمنا بتوظيف قبل الفجر علاج البرد من 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (من الساعة 8:30 AM-9: 00 ص) إلى تقليدالشرط قبل الفجر الطبيعية. هذا العلاج البارد قبل الفجر ساعد في مزامنة anthesis في الوالدين. لاحظنا أنه على الرغم من تحديد غرفة لمستويات الرطوبة النسبية 50٪، وزيادة الرطوبة النسبية داخل الغرفة إلى مستوى فوق 70٪ كما انخفضت درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 15 درجة مئوية، واستمرت في البقاء فوق 70٪ حتى درجة حرارة وارتفعت تدريجيا إلى 31 درجة مئوية بعد 9:30 صباحا. في الساعة 9:00 صباحا، عاجزة الآباء الإناث ويتم جلب النباتات من الأم الذكور إلى المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪). الزهور من الآباء الذكور بدء الافتتاح حوالي 10:10، ويمكن إجراء التلقيح الساعة 10:30 AM-11: 00 PM. وترد قائمة مفصلة لجميع الكواشف والمعدات في الجدول 2.
أهمية إعداد باقه ورد لخصاء
في ظل الظروف الغرفة في هذه الدراسة (الشكل 1)، ومدة تتفتح باقه ورد الأولية تراوحت2-3 أيام. عادة، والزهور التي تقع في منتصف البعيدة من الإزهار (الشكل 2A) أولا فتح وفتح قريب وبشكل أقصى يسبق. العدد المثالي من الزهور إلى الإبقاء على باقه ورد هو 20-30. وينبغي اتخاذ الحذر أثناء إزالة الزهور غير ناضجة بحيث يتم الاحتفاظ فقط الزهور متطورة (في أعلى زهرة أو أكبر على السنيبلات 17). وضع العلامات مع علامة حمراء على كلا الجانبين من الزهور يساعد على تمييز كفاءة ذرية هجين الأباعد المفترضة من البذور من الزهور وضعت حديثا بعد خصاء. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن يترك شعيرات على عناقيد قبل خصاء لحماية زهيرات من ضرر الحرارة واسعة، ولكن كخيار، ويمكن إزالتها بعد خصاء باستخدام مقص الربيع من أجل تسهيل عملية التلقيح، وخصوصا عندما ملزمة لباقه ورد ويستخدم تقنية (أرقام 2C و 2D).
الأمثل لدرجة الحرارةمدة العلاج د لمعالجة المياه الدافئة
الأساس لخصاء من خلال غمس الماء الدافئ هو أن حبوب اللقاح هو أكثر حساسية للحرارة من سطح بغيض. ومع ذلك، فإن مدة ودرجة حرارة المعالجة الحرارية قد تختلف بين الأنواع الهلبانة والانضمام. بشكل عام، فإن درجة حرارة أعلى مع وقت العلاج أقصر أو انخفاض درجة الحرارة مع الوقت العلاج يعد لها نفس التأثير على خصاء. وقد أفيد أن المعالجة الحرارية من 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو 10 47 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة 14 المقدمة S. لم يحدد ITALICA حبوب اللقاح غير قابلة للحياة، ولكن كفاءة هذه العلاجات. وقد وضعنا لدينا بروتوكول التالية فرضية أنه في ظل درجة حرارة الوجه الأمثل، ومدة العلاج، وحبوب اللقاح من كل الزهور على الاحتفاظ سوف الوالد الإناث تكون غير قابلة للحياة في حين الوصمات ستبقى تقبلا. ومع ذلك، بعد مقارنة وتحليل آثار العديد من درجات الحرارة وفترات العلاج (الجدول 1)، وجدنا أن حساسية إلى المعالجة الحرارية تختلف بين الزهور الإبقاء على كل الدالية، وبالتالي فإنه من الصعب للقضاء على البذور الناتجة من التلقيح الذاتي تماما. نستنتج أن كفاءة إنتاج ذرية هجين الأباعد هو أعظم عندما يتم تنفيذ العلاجات في 48 درجة مئوية لمدة 3-6 دقيقة في S. VIRIDIS الانضمام A10.1.
وقت الذروة من anthesis وتلاقح
عندما تصل إلى النضج والزهور على وشك فتح، المتك هي بيضاء صفراء اللون ويسفك حبوب اللقاح في أقرب وقت exsert المتك من الزهور 8. المتك تتحول تدريجيا البني بعد إلقاء حبوب اللقاح حيث تبدأ الزهور إغلاقه. بمجرد الافراج عنهم، والجدوى من حبوب اللقاح غير معروف. لذا، فمن الأهمية بمكان أن استخدام حبوب اللقاح من الزهور فتح أو فتح حديثا على الأصل الذكور في أقرب وقت ممكن. في ظل ظروف لدينا غرفة (الشكل 1)، فإن غالبية ابحث عن المزيدالتمرير من الآباء الذكور تبدأ في فتح الساعة 10:10 صباحا والزهور فتحت تسليط حبوب اللقاح الساعة 10:30 PM. وبالتالي، فإن من المرغوب فيه نافذة لأداء التلقيح هو 10:30 حتي 11:00. تبقى الوصمات خارج glumes بعد الزهور وثيقة وتقبلا قد يكون لحبوب اللقاح. وقد لوحظ هذا في السابق، وأكد في S. ITALICA أن الوصمات هي تقبلا لمدة 48 ساعة بعد الافتتاح سيليس زهرة وآخرون. 6، ولذلك فمن المهم أن حقيبة عناقيد التالية المعالجة الحرارية وبعد أداء الصلبان التي تسيطر عليها. كما نوقش أعلاه، نوصي pollinations الأداء على حد سواء يوم 2 ويوم 3 بعد خصاء.
طرق للتلقيح
قارنا كفاءة ثلاث تقنيات التلقيح. إذا تتفتح الزهور لا يحد، باقه ورد إلى باقه ورد التلقيح هو الأسلوب الأكثر فعالية وسوف تسفر عن عدد أكبر من ذرية هجين الأباعد. إذا عناقيد تتفتح تحد، تردد أعلى من سوسيتم إنتاج ذرية utcross عندما يتم استخدام الأسلوب العضو الذكري إلى وصمة العار. لقد حصلنا على ذرية هجين الأباعد من الطريقتين بنجاح. وقد استخدم أسلوب "عناقيد ملزمة" في عبور S. ITALICA 6 لكننا وجدنا هذا الأسلوب ليكون الأسلوب الأقل كفاءة باعتبارها نافذة الوقت لحبوب اللقاح سفك الوالد الذكور قصيرة. علاوة على ذلك، هناك أقل من السيطرة على التلقيح وشعيرات على S. قد عناقيد VIRIDIS أيضا تعيق حركة حبوب اللقاح على سطح بغيض.
حصاد البذور، والتجفيف والتخزين
بعد الحصاد، وينبغي أن يجفف في البذور 30-33 درجة مئوية لمدة 2 ايام. Anthecium يجب إزالة لتلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، إذا لزم الأمر. يجب أن يتم تخزين البذور في مكان بارد وجاف (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪) للتخزين على المدى القصير (أقل من سنتين) أو في غرفة البذور (T: 4.0 10 ° C ± 1.0 درجة مئوية، RH: 20٪ ± 1٪) للتخزين على المدى الطويل.ظروف التخزين السيئة قد تؤدي إلى انخفاض معدلات بقاء 8. وقد لاحظنا أن معدل إنبات S. VIRIDIS A10.1 ما يقرب من 5٪ عندما زرعت بعد 4 أيام الحصاد، ولكن يمكن زيادتها إلى 90-96٪ بعد التخزين في المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪) ل110 يتبع أيام ما بعد الحصاد من قبل الطبقات لمدة ثلاثة أيام في -80 درجة مئوية إلى كسر سكون البذور. لالطبقية في -80 درجة مئوية، والبذور الجافة يمكن وضعها في وعاء محكم (مثل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة أو مغلف عملة في كيس من البلاستيك مختوم) والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمدة 3 أيام قبل الزراعة. بعد 16 شهرا من التخزين في المختبر (T: 24.06 ± 0.13 ° C ° C، RH: 21.79٪ ± 1.15٪)، لا يزال من الممكن الحصول على نسبة الإنبات من 90-95٪. بالإضافة إلى ذلك، لكسر السكون، والبذور يمكن أن تجفف في 30-33 درجة مئوية لمدة 2 أيام بعد الحصاد، وقدمت بعد ذلك التقسيم الطبقي لمدة ثلاثة أيام في -80 درجة مئوية تليها إزالةanthecium قبل الزراعة. بعد هذه العلاجات، ويمكن تحقيق معدلات إنبات البذور لمدة تصل إلى 33٪.
المزايا والقيود والتعديلات الممكنة
هنا نقدم البروتوكول القياسي الأول لأداء الصلبان في S. VIRIDIS A10.1 باستخدام المعالجة الحرارية للخصاء. وعلى النقيض من خصاء المادية، وهذا البروتوكول هو أقل الغازية وسهلة نسبيا للوضع في المختبر. وعادة ما يستغرق حوالي 15 دقيقة لتقليم باقه ورد واحد وحوالي 15 عناقيد ويمكن خفض وعبرت / شخص / يوم. على افتراض ما معدله 3-5 هجين الأباعد ذرية / الدالية يمكن استردادها في ظل ظروف الأمثل، ما مجموعه 45-75 ذرية هجين الأباعد يمكن أن تنتج من قبل شخص واحد في يوم واحد. علاوة على ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها على الصلبان في الأنواع الأخرى الهلبانة، على الرغم من التحسينات الإضافية سوف تكون على الأرجح. إذا كان مساحة محدودة غرفة النمو، والنباتات يمكن زراعتها في البيت الأخضر أو دوائر النمو دون trea قبل الفجرtment حتى يخرج باقه ورد قبل أن يتم نقلها إلى غرفة الظروف الأمثل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Sankalpi Warnasooriya وايمي هومبولت لقراءة نقدية وتحرير المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الطاقة (DE-SC0008769) والمؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-1127017).
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. . Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
