Verfahren für Kreuze in<em> Setaria viridis</em>, Ein New Model System für die Gräser
Summary
Wir haben eine Methodik für die Durchführung Kreuze in Setaria viridis (S. viridis) entwickelt. Das Verfahren beinhaltet das Beschneiden der Rispe vor einer Heißwasserbehandlung, um lebensfähige Pollen zu töten. Kreuze werden nach einem gut kontrollierten Wachstum Regime durchgeführt und in der Regel bei der Gewinnung von 1 bis 7 Quer bestäubt-Saatgut / s pro Rispe führen.
Abstract
Setaria viridis ist eine neue Modellsystem für C 4 Gräser. Es ist eng mit der Bioenergie Futter-Vorrat Rutenhirse und der Getreideernte Kolbenhirse zusammen. Vor kurzem hat die 510 Mb Genom von Kolbenhirse, S. italica, wurde sequenziert 1,2 und eine 25-fache Abdeckung des Genoms relativ schmächtig S. viridis ist in Arbeit. S. viridis hat eine Reihe von Eigenschaften, die es ein potentiell hervorragendes Modell genetische System mit einem schnellen Generationszeit, kleine Statur, einfache Wachstumsanforderungen, fruchtbare Samenproduktion 3 und entwickelten Systeme sowohl für transiente und stabile Transformation 4 zu machen. Jedoch die Genetik von S. viridis weitgehend unerforscht, teilweise aufgrund des Fehlens von detaillierten Verfahren zum Ausführen von Kreuzungen. Bis heute hat keine Standard-Protokoll verabschiedet, die schnelle Produktion von Saatgut aus kontrolliert Kreuze erlauben.
Die Protokolldrucktierte hier ist für die Durchführung genetischer Kreuze in S. optimiert viridis, Beitritt A10.1. Wir haben ein einfaches Wärmebehandlung mit warmem Wasser für Entmannung nach dem Beschneiden der Rispe zu 20-30 Röschen und Kennzeichnung von Blumen zu behalten, um Samen von neu entwickelten Blüten nach Entmannung zu eliminieren beschäftigt. Nach der Prüfung einer Reihe von Wärmebehandlungen bei permissiven Temperaturen und Variieren der Dauer des Eintauchens, haben wir eine optimale Temperatur-und Zeitbereich von 48 ° C für 3-6 min hergestellt. Durch Verwendung dieses Verfahrens kann ein Minimum von 15 Kreuzungen von einem einzigen Arbeiter pro Tag durchgeführt werden, und durchschnittlich 3-5 outcross Nachkommen pro Rispe wiederhergestellt werden können. Daher kann ein Durchschnitt von 45-75 outcross Nachkommen von einer Person an einem Tag hergestellt werden. Grundzüge der Implementierung dieser Technik wird die Entwicklung von rekombinanten Inzuchtlinie Populationen von S. erleichtern X S. viridis viridis oder S. X S. viridis italica, Kartierung Mutationen durch Groß segregant Analyse und Erstellung von höherer Ordnung Mutanten für die genetische Analyse.
Introduction
S. viridis ist eine NADP-ME-Subtyp C 4 Gras eng mit der Bioenergie Futter-Vorrat Rutenhirse (NAD-ME Subtyp), der Getreideernte Kolbenhirse und landwirtschaftlichen Versuchs Unkraut Gras 5 zusammen. Die 510 Mb Genom der Zuchtform Setaria, S. italica, wurde kürzlich sequenziert 1,2 und eine 25-fache Abdeckung des Genoms relativ schmächtig, S. viridis, ist in Arbeit (unveröffentlicht). S. viridis hat eine Reihe von Eigenschaften, die es ein potentiell hervorragendes Modell genetische System mit einem schnellen Generationszeit, kleine Statur, einfache Wachstumsanforderungen und fruchtbare Samenproduktion 3 zu machen. Wichtig ist, daß Methoden kürzlich sowohl transiente und stabile Transformation von S. entwickelt viridis, die die Möglichkeit zur Schaffung von transgenen Pflanzen 4 vorzusehen. Doch ein großer Engpass bei der Entwicklung genetischer Werkzeuge für S. viridis ist seine recalcitrance zu Auskreuzung. Bis heute hat kein Standardprotokoll veröffentlicht worden, die schnelle Produktion von Saatgut aus kontrolliert Kreuze erlauben.
Genetische Kreuze in S. italica werden üblicherweise durch Entmannung durch Entfernung der Staubbeutel aus Blumen 6,7,8 oder durch Wärmebehandlung von Blüten der weiblichen Eltern 9-11 durchgeführt. Nach diesen Behandlungen, Staubbeutel oder Rispen von nicht-behandelten Blüten / männlich Eltern sanft gegen Narben frei Pollen abgerieben. In Entmannung, sind Staubbeutel mit einer feinen Pinzette sofort nach dem Blümchen öffnet und der Staubbeutel beginnt exsert entfernt, ist aber noch nicht vergossen Pollen 6-8. Unter den Herausforderungen dieser letzteren Verfahren ist die Schwierigkeit bei der Durchführung Schwächung in einem schmalen Zeitintervall zwischen dem Öffnen und Pollen Schuppen der Blume. Die Dauer der Öffnungs-und Schließ einer einzigen Blume wird in Abhängigkeit von der Beitritts-und Umweltbedingungen variieren und kann von 7 min reichen <sup> 6-2,5 h 12 in S. italica. Da Shedding von Pollen tritt als Antheren exsert von Blümchen, müssen Staubbeutel sorgfältig und schnell entfernt werden, und daher ist es schwierig, Verunreinigungen durch Selbstbestäubung zu vermeiden. Zusätzlich, wie Bestäubungen unmittelbar nach Kastration ausgeführt wird, ist die Anzahl von Kreuzungen, die pro Person pro Tag durchgeführt werden kann / begrenzt.
Als alternative Methode kann reifen Rispen in warmen Wasser getaucht werden, um Wärme-kill Entwicklung Pollenkörner 9,10,13,14 mit dem Vorteil der Durchführung Kreuze auf einer großen Anzahl von Rispen. Die Temperatur und Dauer der Wärmebehandlung variiert jedoch stark von verschiedenen Experimenten (zB 47 ° C für 10 min 14 und 42 ° C für 20 min 10). Weiterhin keine systematischen Analysen über die Wirksamkeit von Wärme-vermittelte Entmannungen veröffentlicht worden. Somit ist ein Standard und einfaches Verfahren zur Durchführung der genetischen Kreuzungen in S. viridis würde genetische Ressource Entwicklung und Etablierung von S. stark beschleunigen viridis als Modellsystem in der Forschungsgemeinschaft.
Wir berichten über die Entwicklung und Optimierung von einem Standard-Protokoll für die Durchführung genetischer Kreuze in S. viridis. Pflanzen werden unter kontrollierten Umgebungen Blütenentwicklung synchronisieren und erhöhen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens geworden. Kreuze werden mit einer transgenen S. durchgeführt viridis Zeile wie das männliche Elternteil, die das GUS-Reportergen 4 um die Identifizierung erfolgreich gesteuert genetischen Kreuzungen zu erleichtern. Die GUS-Transgen durch einen Ubiquitin-Promotor, der Reis das Zählen von F1 Samen sofort nach der Ernte und ermöglicht somit bequem qualitativen Assay, um die Effizienz der Schwächung und der Bestäubung bestimmen angetrieben. Wir haben ein einfaches Wärmebehandlung mit warmem Wasser für Entmannung begleitet von Blumen, die Kennzeichnung von emascula gewesen sind eingesetztted Samen von neu entwickelten Blüten nach Entmannung zu eliminieren. Nach der Prüfung einer Reihe von Wärmebehandlungen bei permissiven Temperaturen und Variation der Dauer Eintauchen in warmes Wasser haben wir eine optimale Temperatur-und Zeitdauern von 48 ° C 3-6 min etabliert. A pre-dawn Kältebehandlung wurde festgestellt, Synchron Blüte in beiden Eltern, um Fremdbestäubung zu erleichtern fördern. Wir haben auch die wichtigsten Schritte in der Protokoll-und der künftigen Anwendung dieser Methode auf andere Setaria Beitritte diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bedeutung der pre-dawn Behandlung
Um eine hohe Frequenz von Outcross Nachkommen zu erhalten, ist es wichtig, hochsynchronen Blüte der männlichen und weiblichen Eltern haben. Zunächst fuhren wir Temperatur-und Lichtsysteme (31 ° C/22 ° C Tag / Nacht) und nutzte die S. viridis Beitritt A10.1 für alle Befruchtungen. Unter diesen Bedingungen, öffnen die meisten Blumen am frühen Morgen, bevor die Temperatur steigt auf 31 ° C, obwohl einige Blüten geöffnet zufällig zwischen 08.00 Uhr-8: 00 PM. Frühere Studien in S. italica zeigen, dass die Tageszeit, Standort und Jahreszeit dazu beitragen, in der Blüte 7,15,16 variante. Siles et al. 6 darauf hingewiesen, dass der Blüte wurde mit raschen Veränderungen in Temperatur und Luftfeuchtigkeit verbunden, aber nicht mit niedriger Temperatur und hoher Luftfeuchtigkeit, an sich, wie in früheren Studien 7,15 abgeschlossen. Deshalb beschäftigten wir pre-dawn Kältebehandlung von 15 ° C für 30 min (ab 08.30 Uhr-9: 12.00 Uhr) zu imitierendie natürliche pre-dawn Zustand. Das pre-dawn Kältebehandlung bei der Synchronisierung der Blüte bei den Eltern unterstützt. Wir beobachteten, dass, obwohl die Einstellung der Kammer für eine relative Luftfeuchtigkeit von 50%, die relative Feuchtigkeit in der Kammer auf ein Niveau von über 70%, wenn die Temperatur sank von 22 ° C bis 15 ° C und weiter auf über 70% zu bleiben, bis die Temperatur stieg allmählich auf 31 ° C nach 09.30 Uhr. Um 9:00 AM, entmannt weiblichen Eltern und Pflanzen der männlichen Eltern werden ins Labor gebracht (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). Blumen der männlichen Eltern beginnen Öffnung um 10.10 Uhr, und der Bestäubung kann um 10:30 Uhr-11 durchgeführt werden: 00.00. Eine detaillierte Liste mit allen Reagenzien und Geräte ist in Tabelle 2 angegeben.
Die Bedeutung der Rispe Vorbereitung für Entmannung
Unter den Kammerbedingungen in dieser Studie (Abbildung 1), die Dauer der Primär Rispe Blüte reichte von2-3 Tage. Typischerweise Blumen am distalen Mitte des Blütenstandes (Abbildung 2A) offene erste und Öffnungsvoran proximal und distal. Die ideale Anzahl von Blumen auf der Rispe beibehalten 20-30. Bei der Entfernung von unreifen Blüten sollten Vorsicht genommen, so dass nur gut entwickelten Blüten (die oberste Blume oder auf der größten Ährchen 17) beibehalten werden. Die Markierung mit roten Marker auf beiden Seiten der Blumen hilft, effizienter zu unterscheiden mutmaßlichen Outcross Nachkommen von Samen aus neu entwickelten Blüten nach Entmannung. Darüber hinaus ist es wichtig, die Borsten auf den Rispen vor Entmannung zu verlassen, um die Blüten aus dem umfangreichen Hitzeschäden zu schützen, aber als Option, sie können nach der Entmannung mit Feder Schere, um die Bestäubung zu erleichtern entfernt werden, insbesondere wenn eine Rispe verbindlich Technik eingesetzt wird (2C und 2D).
Optimierte Temperatur eind Behandlungsdauer für Warmwasseraufbereitung
Die Grundlage für die Entmannung durch warmes Wasser Tauchen ist, dass Pollen ist empfindlicher auf Hitze als die Narbenfläche. Allerdings kann die Dauer und Temperatur der Wärmebehandlungen unter Setaria-Arten und Beitritte variieren. Im allgemeinen wird eine höhere Temperatur eine kürzere Behandlungszeit oder einer niedrigeren Temperatur mit einer längeren Behandlungszeit die gleiche Wirkung auf die Schwächung. Es wurde berichtet, dass eine Wärmebehandlung von 42 ° C für 20 min 10 oder 47 ° C für 10 min 14 wieder S. italica Pollen nicht lebensfähigen, aber die Effizienz dieser Behandlung wurde nicht bestimmt. Wir haben unser Protokoll nach der Hypothese, dass unter einer optimierten Temperatur und Dauer der Behandlung, Pollen aller Blumen beibehalten auf das weibliche Elternteil wird nicht lebensfähig, während Narben empfänglich bleiben entwickelt. Jedoch nach dem Vergleich und Analyse der Wirkungen von verschiedenen Temperaturen undBehandlungszeiten (Tabelle 1) haben wir festgestellt, daß die Empfindlichkeit der Wärmebehandlung variiert je nach dem an jedem Rispe gehalten Blumen, so ist es schwer, Samen aus Selbstbestäubung vollständig zu eliminieren. Wir schließen daraus, daß die Effizienz der Herstellung outcross Nachkommen ist am größten, wenn Behandlungen bei 48 ° C für 3-6 min in S. durch viridis Beitritt A10.1.
Peak-Zeit der Blüte und Fremdbestäubung
Wenn die Blumen Reife erreichen und sind dabei, sich zu öffnen, Staubbeutel sind gelblich-weiß in Farbe und Pollen wird so bald wie Staubbeutel exsert aus den Blüten 8 vergießen. Staubbeutel allmählich braun werden nach Pollen Schuppen wie die Blumen beginnen zu schließen. Einmal freigesetzt, die Lebensfähigkeit der Pollen, ist unbekannt. Daher ist es wichtig, den Pollen von Öffnung oder frisch geöffneten Blüten auf dem männlichen Elternteil, sobald wie möglich zu verwenden. Unter unserem Kammerbedingungen (Abbildung 1), die Mehrheit der flowers der männlichen Eltern beginnen um 10:10 Uhr öffnen und die geöffneten Blüten Pollen vergossen um 10:30 Uhr. Somit ist das wünschenswert Fenster für die Durchführung der Bestäubung von 10.30 bis 11.00 Uhr. Die Narben bleiben außerhalb der Spelzen nach Blumen in der Nähe und können Pollen empfänglich zu sein. Dies wurde zuvor beobachtet worden, und in S. bestätigt italica, dass die Narben sind offen für etwa 48 Stunden nach der Blume, die von Siles et al. 6, so ist es wichtig, Tasche Rispen folgende Wärmebehandlung und nach der Durchführung kontrolliert Kreuze. Wie oben besprochen, empfehlen wir leistungs Bestäubungen sowohl auf Tag 2 und Tag 3 nach der Entmannung.
Methoden für die Bestäubung
Wir verglichen die Wirksamkeit von drei Bestäubungstechniken. Wenn blühenden Blumen sind nicht einschränkend ist Rispe zu Rispe Bestäubung der effizienteste Technik und eine höhere Anzahl von Outcross Nachkommen zu erhalten. Wenn blühenden Rispen begrenzen, eine höhere Frequenz von outcross Nachkommen produziert werden, wenn der Staubbeutel-zu-Stigma-Methode verwendet wird. Wir haben Outcross Nachkommen von beiden Methoden erfolgreich erhalten. Die "Bindung Rispen"-Methode hat in der Überfahrt S. verwendet italica 6, aber wir fanden diese Methode, um die am wenigsten effiziente Methode sein, da das Zeitfenster für die Pollen Abstoßung der männliche Elternteil ist kurz. Darüber hinaus gibt es weniger Einfluss auf die Bestäubung und die Borsten auf S. viridis Rispen kann auch die Bewegung der Pollen auf die Narbenfläche zu behindern.
Seed Ernte, Trocknung und Lagerung
Nach der Ernte sollten Samen bei 30-33 ° C für 2 Tage getrocknet. Anthecium sollte für GUS-Färbung entfernt werden, falls erforderlich. Samen sollten an einem trockenen, kühlen Ort gelagert werden (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) für die kurzfristige Lagerung (weniger als zwei Jahre) oder in einer Saatgutkammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, relative Feuchtigkeit 20% ± 1%) für die langfristige Lagerung.Schlechte Lagerbedingungen können in niedrigen Raten Lebensfähigkeit 8 führen. Wir haben beobachtet, dass die Keimrate von S. viridis A10.1 etwa 5%, wenn gesät 4 Tage nach der Ernte, sondern kann auf 90-96% nach der Lagerung im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%) erhöht werden für 110 Tage nach der Ernte, gefolgt von einer dreitägigen Schichtung bei -80 ° C bis Samenruhe zu brechen. Für die Schichtung bei -80 ° C, trockenen Samen in einem luftdichten Behälter (zB Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Münze in einem verschlossenen Umschlag Plastiktüte) platziert werden und für 3 Tage vor dem Pflanzen gehalten bei -80 ° C. Nach 16 Monaten Lagerung im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%), kann die Keimung Prozentsatz der noch 90-95% erhalten werden. Darüber hinaus, um die Keimruhe zu brechen, Samen können bei 30-33 ° C für 2 Tage nach der Ernte getrocknet werden, und dann bei drei-Tage-Schichtung bei -80 ° C, gefolgt von der Entfernung deranthecium vor dem Einpflanzen. Nach diesen Behandlungen können die Samenkeimung Raten von bis zu 33% erreicht werden.
Vorteile, Grenzen und mögliche Änderungen
Hier stellen wir die erste Standard-Protokoll für die Durchführung Kreuze in S. viridis A10.1 durch Verwendung einer Wärmebehandlung für Entmannung. Im Gegensatz zu physikalischen emasculation ist dieses Protokoll weniger invasiv und relativ einfach im Labor herzustellen. Es dauert in der Regel etwa 15 Minuten, um eine Rispe schneiden und etwa 15 Rispen können getrimmt und überquerte / Person / Tag werden. Bei durchschnittlich 3-5 Outcross Nachkommen / Rispe können unter optimierten Bedingungen gewonnen werden, können insgesamt 45-75 Outcross Nachkommen von einer Person an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus kann diese Technik angewandt werden, um in anderen Setaria-Arten kreuzt, wenn zusätzliche Optimierungen wahrscheinlich. Wenn Wachstumskammer der Platz begrenzt ist, können die Pflanzen im Gewächshaus oder Wachstumskammern ohne pre-dawn TREA angebaut werdentment bis der Rispe tritt, bevor sie den optimierten Bedingungen Kammer bewegt werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sankalpi Warnasooriya und Amy Humboldt für das kritische Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Department of Energy (DE-SC0008769) und der National Science Foundation (IOS-1127017) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
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